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第一章IGF-IR在人胃癌中的表达及临床意义目的:探讨IGF-IR在人胃癌组织中的表达及临床意义。方法:采用RT-PCR和Western blot方法检测50例手术切除胃癌、癌旁及手术切缘非癌组织中IGF-IRmRNA和蛋白的表达。采用免疫组化的方法检测113例手术切除胃癌组织及30例胃镜下活检非癌胃粘膜上皮组织中IGF-IR的表达。结合胃癌患者临床病理特征和术后生存随访资料分析临床意义。结果:在50例新鲜标本中,92.0%（46/50）的胃癌组织,62.0%（31/50）的癌旁组织以及56.0%（28/50）的非癌组织中可检测到IGF-IR mRNA的表达.胃癌组织中IGF-IR mRNA的平均表达水平明显高于癌旁及非癌组织（2.25±0.43 vs.2.02±0.16 & 1.93±0.46,P＜0.05）。而IGF-IRmRNA在癌旁组织中的表达略高于非癌组织无显著性差异（P=0.34）。Western blot结果显示:在86.0%（43/50）的胃癌组织中,60.0%（30/50）的癌旁组织和58.0%（29/50）的非癌组织中可以检测到IGF-IR蛋白的表达,GC中IGF-IR蛋白的阳性表达率显著高于PC和NC（P＜0.01）。半定量分析IGF-IR蛋白在胃癌组织中的平均表达水平明显高于癌旁和非癌组织（1.86±0.30 vs.1.72±0.24 & 1.14±0.10,P＜0.01）;而其在癌旁组织中的表达也较非癌组织中高（P＜0.01）。IGF-IR mRNA和蛋白的表达水平与胃壁浸润深度、区域淋巴结转移、临床病理分期（TNM分期）密切相关（P＜0.05）。免疫组化检测显示:IGF-IR蛋白染色定位与细胞膜和细胞浆,在非癌胃粘膜上皮细胞中IGF-IR蛋白阳性表达率为66.7%（20/30）且多为弱阳性染色,而在胃癌细胞内阳性表达率为72.6%（82/113）呈现粗大的棕色的强阳性染色,IGF-IR蛋白在胃癌细胞的表达明显增强（P＜0.01）。IGF-IR蛋白在胃癌组织中的表达与患者性别、年龄、癌灶原发部位、幽门螺杆菌感染与否以及有无远处转移无关（P＞0.05）;与胃壁浸润深度、区域淋巴结转移、胃癌细胞的组织分化程度有关（P＜0.05）,IGF-IR在Ⅲ+Ⅳ期患者胃癌细胞中表达明显强于Ⅰ+Ⅱ期（P＜0.05）。生存率分析显示,113例胃癌患者手术后平均生存时间为44.6月,中位生存时间为39.0月。组间比较IGF-IR高表达组胃癌患者手术后生存率明显降低（P＜0.05）。结论:1.IGF-IR在胃癌组织中表达上调,与在非胃癌组织中的表达存在显著性差异,IGF-IR表达与癌细胞分化程度、区域淋巴结转移数目、胃壁浸润深度及患者临床病理分期密切相关:提示IGF-IR可能参与了胃癌的发生发展;2.IGF-IR蛋白过量表达与胃癌患者预后不良密切相关,IGF-IR可能成为反映胃癌预后的一个新的肿瘤标志物。第二章靶向IGF-IR的逆转录病毒siRNA表达载体的构建目的:构建靶向IGF-IR的siRNA表达载体,并进一步研究其对人胃癌细胞BGC823的IGF-IR表达的抑制效应。方法:利用逆转录pSUPER/H1质粒构建IGF-IR特异性siRNA表达载体和对照组表达载体,并用PCR电泳及基因测序予以鉴定。IGF-IR特异性siRNA表达载体以脂质体法转染胃癌细胞BGC823,48小时后用RT-PCR,Western blot法分别检测IGF-IRmRNA和蛋白的表达水平。结果:成功构建靶向IGF-IR的siRNA表达载体和对照组表达载体,分别命名为pSUPER-IGF-IR-siRNAl,pSUPER-IGF-IR-siRNA2和pSUPER-Control-siRNA。pSUPER-IGF-IR-siRNA1和pSUPER-IGF-IR-siRNA2转染组IGF-IR mRNA和IGF-IR蛋白的表达量明显低于pSUPER-Control-siRNA转染组及PBS处理的阴性对照组（P＜0.05）。结论:利用逆转录病毒载体成功构建了有效沉默胃癌细胞IGF-IR目的基因的siRNA质粒。第三章IGF-IR干扰对胃癌BGC823细胞生物学行为的影响目的:研究RNAi介导IGF-IR基因沉默对胃癌细胞BGC823增殖、凋亡及侵袭转移的影响。方法:用靶向IGF-IR的siRNA质粒表达载体转染胃癌细胞0h、24h、48h、72h,用MTT法检测BGC823细胞的增殖活性。IGF-IR特异性siRNA表达载体转染BGC823细胞48h,并用流式细胞技术检测细胞周期的变化,同时应用PI染色、DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;用细胞侵袭实验、划痕愈合实验评价BGC823侵袭转移能力的变化。结果:IGF-IR特异性siRNA表达载体转染胃癌细胞后24h,细胞增殖无明显变化,48h、72h活细胞数明显减少,且抑制率分别为62.15±0.98%和59.82±0.68%明显增高（P＜0.05）,但48h和72h组间比较无显著性差异（P＞0.05）。分析细胞周期变化在第48小时,G0/G1期,S期和G2/M期的细胞百分比分别为59.42±4.01%,37.83±2.13%和3.71±0.18%,较pSUPER-Control-siRNA与PBS处理的阴性对照组G1期细胞数明显增多（P＜0.05）。细胞侵袭实验中pSUPER-IGF-IR-siRNA2转染组穿过人工膜的细胞数量显著少于pSUPER-Control-siRNA及PBS阴性对照组（98.33±11.37 vs.128.33±5.69 &135.33±7.77）（P＜0.05）。划痕愈合实验中,划痕后12h开始愈合距离出现明显差异,划痕后36小时细胞计数显示,pSUPER-IGF-IR-siRNA2转染组细胞显著少于pSUPER-Control-siRNA组及PBS阴性对照组为（58.00±11.00 vs.116.67±12.10&122.67±11.15）（P＜0.05）。划痕后36h,pSUPER-Control-siRNA组及PBS阴性对照组划痕已基本愈合,而pSUPER-IGF-IR-siRNA2转染组只愈合了约40%。结论:1.IGF-IR在胃癌细胞BGC823的高表达可能在抑制胃癌细胞凋亡,促进胃癌细胞的增殖中起重要作用;2.IGF-IR沉默表达可显著抑制BGC823细胞侵袭运动转移潜能,IGF-IR可能在调控胃癌发生侵袭转移过程中其关键性作用。第四章基于免疫共沉淀-免疫印迹-质谱技术鉴定胃癌中IGF-IR作用分子的研究目的:探讨IGF-IR蛋白相互作用的功能蛋白,研究IGF-IR在胃癌细胞中的调控作用机制。方法:利用免疫共沉淀和质谱分析技术相结合,先采用免疫共沉淀技术从胃癌BGC823细胞中富集IGF-IR结合蛋白,再采用SDS-PAGE电泳技术对含IGF-IR结合蛋白的复合物进行分离,染色,切取差异蛋白条带,经脱色、还原、烷基化、原位酶解、样品萃取、脱盐及点样,然后采用ESI-MS/MS分析,分析结果peaklist文件输入Mascot查询系统进行检索查询。结果:获得包括Sorcin蛋白在内的24个蛋白点结果数据。结论:利用免疫共沉淀和质谱技术相结合分析胃癌细胞中IGF-IR相互作用蛋白具有可行性。IGF-IR和Sorcin蛋白相互作用的机制可能和胃癌的发生发展及胃癌细胞耐药有关。