下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA）是公认的应激反应标志轴。促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropinreleasing hormone，CRH）是下丘脑分泌的调节HPA轴功能的多肽类激素，也是机体应激反应时发挥神经内分泌调节的关键激素。近年来发现，CRH不仅在HPA轴调节中起着重要作用，其作为一种重要的神经递质，在情绪反应、学习记忆和神经系统损伤与发育中也起着重要作用。海马是边缘系统的重要组成部分，是HPA轴应激反应的高位调节中枢，参与了情绪、学习和记忆、行为、免疫等的调节，对应激反应非常敏感且易损，它的损伤在各种应激所致疾患中起到关键作用。研究表明，慢性应激可能通过增加海马神经元细胞凋亡，导致海马损害，诱发抑郁症等神经精神疾病。因为位于海马CA1区的锥体细胞表达丰富的糖皮质激素受体，而在应激状态下，肾上腺分泌糖皮质激素增多，其可以顺利通过血脑脊液屏障作用于中枢。因此，长期以来，很多学者一直认为应激对海马功能发挥效应是通过糖皮质激素及其受体介导的。但近年来，很多实验结果并不支持这一观点。动物实验发现，当切除肾上腺后，慢性应激同样可以对海马功能产生影响。越来越多的研究结果显示，作为HPA轴的关键调节因子，CRH及其受体参与介导应激对海马结构和功能产生影响，并且这一作用是独立于糖皮质激素的，但是关于CRH导致神经元损伤的机制至今尚不清楚。细胞凋亡（apoptosis）是细胞死亡的主要形式之一。目前，关于细胞凋亡的发生机制普遍认为有三条通路参与：即线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路。其中内质网通路是新近提出的，可独立诱导细胞凋亡的又一途径，该途径的核心内容是内质网应激（endoplasmic reticulumstress，ERS）。适度的内质网应激可提高内质网处理未折叠或错误折叠蛋白的能力，维持细胞存活；但应激时间过长或程度过强，细胞内稳态不能恢复，内质网应激将最终诱导细胞凋亡。近年来，内质网应激在神经系统疾病发生、发展中的作用受到广泛关注。而关于内质网应激可以引起神经元的凋亡，已在许多神经退行性疾病，如帕金森病，阿尔茨海默病等的发病机制研究中得到证实。基于上述研究现状，我们推测，应激状态下，HPA轴兴奋，CRH产生增多，可以作用于海马神经元导致神经元损伤，内质网应激在介导CRH诱导海马神经元损伤的过程中发挥了重要作用。本研究应用大鼠束缚应激模型和体外原代培养大鼠海马神经元，从整体、细胞水平，系统研究CRH在应激反应中对神经元的损伤作用，并对其内质网应激机制加以深入探讨。第一部分内质网应激介导的束缚应激大鼠海马细胞凋亡目的：通过建立大鼠束缚应激模型，从整体水平研究CRH在应激反应中对海马细胞的损伤作用及CRH受体的参与度，并对其内质网应激机制进行研究。方法：1建立大鼠束缚应激模型，通过脑立体定位和微量注射技术，分别于束缚应激前30min侧脑室注射CRH受体1特异性拮抗剂CP154526、内质网应激特异性抑制剂Salubrinal和等量的生理盐水，监测大鼠体重变化，并对下述指标进行检测。2ELISA法检测大鼠血浆CRH、CORT浓度。3免疫组化方法检测内质网应激标志分子GRP78、CHOP蛋白表达的变化。4Western blot方法检测GRP78、CHOP、Caspase12蛋白表达水平。5流式细胞术Annexin Ⅴ-PI双标染色法检测上述各组大鼠海马细胞凋亡率。结果：1大鼠体重的变化：与正常对照组相比，束缚应激7天后，各组大鼠体重均明显下降（p<0.05）；其中，与单纯束缚应激组或束缚应激前注射生理盐水组相比，束缚应激前侧脑室注射CRH受体1拮抗剂CP154526或内质网应激抑制剂Salubrinal，对大鼠体重没有明显影响（p>0.05）。2ELISA法检测大鼠血浆CRH、CORT浓度的变化：与正常对照组相比，束缚应激7天后，各组大鼠血浆CRH、CORT水平均明显升高（p<0.05）；其中，束缚应激前侧脑室注射CRH受体1拮抗剂CP154526，与单纯束缚应激组或束缚应激前注射生理盐水组相比，血浆CRH、CORT水平均没有明显变化（p>0.05）。3免疫组化法检测内质网应激标志分子GRP78、CHOP蛋白在大鼠海马区的表达：GRP78、CHOP的阳性信号均定位于胞浆，与正常对照组相比，束缚应激组大鼠海马区GRP78、CHOP表达均明显增加；侧脑室注射内质网应激抑制剂Salubrinal后，与单纯束缚应激组或束缚应激前注射生理盐水组相比，GRP78、CHOP的阳性表达均明显降低。4Western blot检测GRP78、CHOP、Caspase12蛋白的表达：与正常对照组相比，束缚应激组大鼠海马细胞GRP78、CHOP、断裂的Caspase12蛋白水平均明显增加（p<0.05）；侧脑室注射内质网应激抑制剂Salubrinal后，与单纯束缚应激组或束缚应激前注射生理盐水组相比，上述蛋白表达水平均明显降低（p<0.05）。5流式细胞术Annexin Ⅴ-PI双标染色法检测各组大鼠海马细胞凋亡率：与正常对照组相比，束缚应激7天后，大鼠海马细胞凋亡率明显增加（p<0.05）；侧脑室注射CRH受体1拮抗剂CP154526或内质网应激抑制剂Salubrinal，与单纯束缚应激组或束缚应激前注射生理盐水组相比，细胞凋亡率均出现显著下降（p<0.05）；而侧脑室注射生理盐水组，与单纯束缚应激组大鼠相比，凋亡率没有明显变化（p>0.05）。结论：在束缚应激大鼠整体水平，CRH通过CRH受体1作用于海马细胞，可导致细胞凋亡率明显增加，内质网应激可能参与其中。第二部分内质网应激介导的CRH诱导原代培养大鼠海马神经元凋亡目的：通过体外原代培养大鼠海马神经元，从细胞水平探讨CRH诱导海马神经元凋亡的浓度依赖性及时间依赖性，研究CRH诱导的内质网应激在其中的作用机制。方法：1原代培养大鼠海马神经元，免疫细胞化学及免疫荧光法对神经元进行鉴定。2MTT实验评价不同浓度的CRH(10^-9M-10^-5M)作用不同时间（1、4、8、16、24、48h）对海马神经元细胞存活率的影响。3为了明确CRH是否导致了海马神经元的凋亡以及CRH受体的参与度，采用CRH受体1拮抗剂（CP154526）与CRH(10^-8M)共同孵育神经元，TUNEL技术原位检测细胞凋亡情况。4加用内质网应激抑制剂Salubrina（lSal）或内质网诱导剂tunicamycin（TM）作用于海马神经元，Western blot方法检测内质网应激标志分子GRP78、CHOP、Caspase12蛋白的表达，Real-time PCR检测GRP78、CHOPmRNA的表达。5流式细胞术Annexin Ⅴ-PI双标染色法检测细胞凋亡率。结果：1海马神经元原代培养结果：原代培养至7天时，神经元胞体丰满，周围光晕明显，立体感强，突起延长，交织成网络。此时神经元发育成熟，是用于实验研究的最佳时期。用神经元特异性标记物MAP2对海马神经元进行鉴定，神经元纯度达90%以上，可以用于后续实验。2MTT实验检测CRH对海马神经元细胞存活率的影响：与正常对照组相比，10^-8M至10^-5M的CRH作用于神经元48h后，神经元存活率明显降低（p<0.05或p<0.01），且呈浓度依赖性；而10^-9M的CRH对神经元存活率没有明显影响。CRH(10^-8M)作用于海马神经元1、4、8h，细胞存活率没有明显变化（p>0.05），作用16h后，细胞存活率明显降低（p<0.05），并呈时间依赖性。3TUNEL技术原位检测细胞凋亡情况：与正常对照组相比，CRH作用后神经元TUNEL阳性表达明显增加（p<0.05），而加用CP154526后，TUNEL阳性表达明显降低（p<0.05），说明CRH通过CRH受体1导致海马神经元凋亡。4Western blot检测GRP78、CHOP、Caspase12蛋白的表达：与正常对照组相比，CRH作用于海马神经元后，内质网应激的关键分子GRP78、CHOP、断裂的Caspase12的蛋白水平均明显增高（p<0.05）；加用内质网应激抑制剂Salubrinal共同作用海马神经元，上述蛋白表达下降（p<0.05）；内质网应激的诱导剂衣霉素tunicamycin（TM）作用后，三种蛋白的表达水平也表现出了显著的升高（p<0.05）。5Real-time PCR检测GRP78、CHOP mRNA的表达：CRH作用于神经元后，GRP78、CHOP mRNA的表达均明显增高，分别为正常对照组的3.28和5.52倍（p<0.05）；内质网应激的抑制剂Salubrinal明显降低了二者的表达（p<0.05）；而衣霉素（TM）的作用也表现出了和预期一致的升高（p<0.05）。6流式细胞术Annexin Ⅴ-PI双标染色法检测细胞凋亡：与正常对照组相比，在CRH作用下，神经元总凋亡率明显升高（p<0.05），且以早期凋亡增加为主；加用内质网应激的抑制剂Salubrinal共同作用海马神经元后，凋亡率明显下降（p<0.05）；内质网应激的诱导剂衣霉素（TM）作用后，凋亡率也表现出了显著的升高（p<0.05）。结论：一定浓度的CRH作用一定时间可独立诱导体外原代培养的大鼠海马神经元凋亡，且呈浓度依赖和时间依赖性，CRH受体1参与了这一过程；内质网应激介导了CRH诱导的海马神经元凋亡。第三部分内质网应激IRE1/ASK1/JNK通路在CRH诱导大鼠海马神经元凋亡中的作用目的：第一、二部分的实验结果表明，CRH通过CRH受体1作用于大鼠海马细胞，可独立诱导细胞凋亡，内质网应激在其中发挥了重要作用。在内质网应激介导凋亡的复杂机制中，IRE1/ASK1/JNK信号转导途径倍受关注，本部分实验将对此途径与神经元细胞凋亡的关系进行研究。方法：1原代培养大鼠海马神经元，应用内质网应激抑制剂Salubrina（lSal）、ASK1抑制剂Thioredoxin（TR）、JNK抑制剂SP600125（SP）分别与10^-8M的CRH共同作用海马神经元48h。2采用Western blot方法检测T-IRE1、p-IRE1、T-ASK1、p-ASK1、T-JNK、p-JNK蛋白表达情况。3采用流式细胞术Annexin Ⅴ-PI双标染色法检测细胞凋亡率。结果：1Western blot检测T-IRE1、p-IRE1、T-ASK1、p-ASK1、T-JNK、p-JNK蛋白表达情况：与正常对照组相比，10^-8M的CRH作用于原代培养的大鼠海马神经元后，p-IRE1、p-ASK1、p-JNK蛋白表达均明显增高（p<0.05），而T-IRE1、T-ASK1、T-JNK表达没有显著变化（p>0.05）；加用内质网应激的抑制剂Salubrinal共同作用海马神经元，p-IRE1、p-ASK1、p-JNK的蛋白表达均下降（p<0.05）；内质网应激的诱导剂衣霉素（TM）作用后，p-IRE1、p-ASK1、p-JNK蛋白表达均显著升高（p<0.05）。上述结果提示10^-8M的CRH作用原代培养的大鼠海马神经元后，内质网应激的IRE1通路是被激活的。2采用流式细胞术Annexin Ⅴ-PI双标染色法检测细胞凋亡率，结果显示，与正常对照组相比，10^-8M的CRH作用于原代培养的大鼠海马神经元后，神经元总凋亡率明显升高（p<0.05），且以早期凋亡增加为主；加用ASK1抑制剂thioredoxin（TR）或JNK抑制剂SP600125（SP）共同作用海马神经元后，总凋亡率均表现出明显的下降（p<0.05），提示内质网应激IRE1/ASK1/JNK信号通路在CRH诱导海马神经元凋亡的过程中发挥了作用。结论：内质网应激通过IRE1/ASK1/JNK通路在CRH诱导的海马神经元凋亡过程中发挥了作用。综上，本实验系统研究了CRH体内、外作用对大鼠海马细胞的影响，提示作为应激时HPA轴反应的关键激素—CRH在海马神经元损伤的过程中发挥了重要作用，内质网应激介导了这一过程。正确评价CRH在应激反应中的作用，可为应激所致精神损害的早期诊断和治疗提供一定的理论依据。