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胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)作为基因修饰强有力的工具,在基因功能基础研究、药物筛选和细胞治疗方面具有广阔的应用前景。然而至今为止,科研工作者仅成功建立小鼠、大鼠、恒河猴和人的ES细胞系。目前制备转基因家畜主要利用体细胞进行基因修饰,然后通过核移植操作获得转基因动物。由于体细胞在体外的增殖能力有限,而且过高代次的供体细胞会影响核移植动物出生的效率。因此对一些效率较低的基因修饰事件,例如基因打靶在体细胞中操作会有很大的困难。导入干细胞多能性相关因子Ocf4、Sox2、Klf4和c-Myc可以将体细胞重编程为类ES细胞,即诱导多能性干细胞(Inducedpluripotentstemcell,iPSCs)。小鼠iPS细胞具有有与ES细胞同等水平的多能性,可以生成嵌合体和四倍体补偿小鼠。目前科研工作者已成功获得了猪和其他大家畜的iPS细胞,建立家畜的iPS细胞可以替代家畜的ES细胞用于基因修饰和早期发育分化的相关研究。目前大量研究集中在猪的诱导多能性干细胞(Porcine induced pluripotent stem cells,piPSCs)上,以期用piPS细胞进行核移植获得piPS核移植猪。然而,piPS细胞核移植效率极低,仅有一例报道出生存活的piPS核移植猪,至今仍没有获得健康存活的核移植猪。目前导致piPS细胞核移植效率低下的原因并不清楚。研究表明iPS细胞不完全的表观重编程和异常表观重编程可能影响iPS细胞的多能性;而核移植动物本身效率低下也与供体细胞的不完全重编程和异常重编程有关。因此本研究从表观遗传修饰入手,研究了 piPS细胞及其核移植胚胎DNA甲基化、基因印记和X染色体失活,试图揭示piPS细胞及其核移植中异常的表观重编程现象。本研究采用基于piggyBac(PB)转座子介导的八因子系统和DOX调控的四因子系统获得piPS细胞。多能性相关标记检测显示呈碱性磷酸酶阳性;免疫荧光染色显示OCT4、NANOG、SSEA1和SSEA3阳性;体内分化成具三胚层的畸胎瘤。用成纤维细胞培养基进行分化获得piPS分化细胞系用于核移植供体。荧光定量PCR检测piPS细胞内源OCT4基因的mRNA表达水平,结果显示检测的piPS细胞中内源OCT4基因表达微弱甚至不表达。甲基化分析发现所有piPS细胞的OCT4甲基化水平与猪成纤维细胞相比去甲基化不完全,甚至出现过高甲基化修饰,piPS细胞的OCT4甲基化程度与内源OCT4基因的表达趋势成反比。运用猪源OCT4启动子启动的GFP报告系统显示piPS细胞的GFP荧光比例与内源OCT4基因表达一致。本研究选择运用荣昌猪和杜洛克杂交猪的胎儿成纤维细胞(Porcine fetal fibroblasts, PFFs)制备杂合子piPS细胞用于研究基因印记,选择了 4个具有SNP位点的印记基因MAGEL2、MIR296、NECDIIN和GtL2。首先,运用焦磷酸测序证明了这4个印记基因在杂合子PFF细胞中印记。在piPS细胞中的焦磷酸分析结果表明,MIR296在4株杂交piPS细胞中维持着印记状态,而MAGEL2和NECDIN在各株piPS细胞中有不同程度的印记丢失现象。而GTL2在所有piPS细胞中出现完全沉默现象。同时,本研究将荣昌和杜洛克杂交品系获得的piPS细胞用于研究X染色体失活(X chromosome inactivation, XCI)情况,找到了在失活X染色体完全沉默的X-linked基因G6PD上的SNP位点用于分析piPS细胞的X染色体失活情况。运用组蛋白H3K27me3免疫荧光染色分析显示可能两条X染色体都活化的piPS细胞中G6PD仍只表达一条X染色体上基因型,说明所有检测的piPS细胞仍存在一条失活的X染色体,本研究检测的piPS细胞中没有类似小鼠中两条X染色体都活化的处于naive状态的piPS细胞。对核移植胚胎OCT4基因启动子区域甲基化分析发现,分化的piPS细胞的核移植胚胎中OCT4基因甲基化程度为44%,高出PFF核移植胚胎15%,与供体细胞的甲基化趋势一致,说明在PFF和piPS分化细胞的核移植胚胎中带有OCT4甲基化修饰记忆。荧光定量PCR结果显示piPS分化细胞核移植胚胎内源的OCT4基因表达量显著低于PFF的核移植胚胎。猪源OCT4启动子启动的GFP报告系统显示,分化的piPS细胞核移植胚胎中无明显可见GFP荧光,而大部分PFF核移植胚胎中有可见GFP荧光,说明OCT4启动子在核移植胚胎中出现了表达抑制的现象。运用组蛋白H3K27me3免疫荧光染色分析piPS细胞核移植胚胎的X染色体失活情况,结果显示与猪体外受精胚胎、孤雌胚胎和核移植胚胎相比,在未分化的piPS细胞核移植胚胎中出现了 X染色体失活不足,而在分化的piPS细胞核移植胚胎中出现了异常的两条X染色体失活现象。本研究采用将两个四细胞期的piPS细胞的核移植胚胎与两个四细胞期的PFF核移植胚胎两两聚合的办法试图补偿piPS细胞核移植过程中产生的异常表观重编程进而提高piPS核移植效率。构建了 824枚聚合囊胚,移植受体猪9头,两头受体猪产下6头GFP荧光猪,经检测没有获得piPS细胞来源的核移植猪。