衰老的发生和演变是生物体不可抗拒的自然过程,随着老年医学的飞速发展,有关衰老机制的学说已有上百种,但至今对衰老是如何发生的仍无确切答案。近年研究人员发现:伴随自然衰老过程,活性氧产物生成增多超过机体清除能力,可致细胞及生物大分子受损,其中对核酸的损害主要表现为DNA氧化受损和修复不足,损伤DNA积累激发变异信号诱导性衰老,最终启动衰老过程。减轻DNA损伤,促进损伤修复必然有利于衰老过程的延缓。作为一种内源性激素,雌激素表现出的延缓自然衰老的作用已被流行病学研究证实,但它对衰老过程中细胞DNA的损伤修复是否具有影响,尚未见相关报道。因此,本研究设计了体内、外试验,观察衰老过程中雌激素作用下DNA损伤修复的变化,探讨其可能的延缓衰老作用机制。伴随衰老进程,神经退行性疾病—阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的发病率呈增高趋势。在AD的发病中,β-淀粉样蛋白（Aβ）的生成、代谢及毒性作用是AD发生的中心环节。Aβ诱导的细胞凋亡是AD神经元丢失的主要原因,因而拮抗Aβ诱导的细胞凋亡是预防AD的重要靶标。雌激素预防AD的作用已得到实验的证实,但植物雌激素-α-玉米赤霉烯醇（α-Zearalanol,α-ZAL）是否具有类似效应,迄今未见报道。本实验设计以雌激素为阳性对照,观察α-ZAL的抗Aβ损伤作用,在细胞水平评价α-ZAL的神经保护作用,为开发新的安全有效的激素替代药物奠定基础。第一部分雌激素减轻DNA氧化损伤,延缓衰老一、体外实验1.应用有限增殖细胞-人胚肺二倍体成纤维细胞（human diploid fibroblasts.HDF）体外培养,发现以无E2血清培养的细胞经50次群体倍增（PD50）后即完全进入衰老状态,而从PD30开始加入E2(10^-8、10^-7、10^-6)持续培养,细胞分别经54、57、59次群体倍增后才进入完全衰老状态,表明雌激素具有延长细胞生命周期的作用,且作用表现出一定的剂量依赖关系。2.在PD50时,10^-6M E2培养细胞中β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数明显少于无E2培养对照细胞（P＜0.05）。表明雌激素可延缓衰老表型的出现,有确实的抗衰老作用。3.通过DCFH-DA免疫荧光染色观察到,伴随PD次数的增加,细胞内源性ROS水平升高,而10^-6M E2可以减缓该升高过程。表明雌激素可以促进活性氧产物的清除。4.Western blotting实验结果显示,DNA损伤修复机制调控的重要因子p53和p21WAF1的表达受E2影响。在PD50时,10^-6M E2培养细胞中p53和p21WAF1的表达低于对照细胞（P＜0.05）,表明雌激素可明显减少DNA损伤及其积累。5.在PD50时,应用流式细胞术分析细胞周期,发现10^-6M E2培养条件下,细胞G1期细胞比例显著低于对照组（P＜0.05）;BrdU免疫组织化学染色结果显示,10^-6M E2培养细胞中BrdU阳性细胞数明显高于对照细胞（P＜0.05）,表明雌激素可以维持DNA复制,延迟细胞周期阻滞的出现。6.单细胞凝胶电泳实验结果显示,与200μM H₂O₂共孵育2h,细胞DNA明显受损,细胞慧尾拉长,而H₂O₂作用后加入10^-6M E2,细胞慧尾长度明显短于单独H₂O₂作用组（P＜0.05）,表明雌激素可以明显促进DNA损伤修复。二、在体实验1.成年雌性C57小鼠随机分为三组:对照组（Control）,假手术加皮下注射生理盐水,腹腔注射芝麻油;模型组（Model）,双侧卵巢切除加皮下注射D-半乳糖100mg/kg.d和腹腔注射芝麻油;E2补充组（ERT）,双侧卵巢切除加皮下注射D-半乳糖100mg/kg.d和腹腔注射E2 50μg/kg.d,D-半乳糖和E2连续使用8w。2.MWM测试发现模型组小鼠寻台潜伏期显著长于对照组（P＜0.01）,而ERT组小鼠寻台潜伏期短于模型小鼠（P＜0.05）,该结果显示雌激素补充可明显改善小鼠空间学习记忆能力。3.比色法测定脑海马抗氧化酶活力及MDA含量。结果表明,与对照组小鼠相比模型组小鼠MDA含量显著升高（P＜0.01）,抗氧化酶SOD及GSH-Px活性显著降低（P＜0.01）,ERT组小鼠上述改变部分逆转。4.组织形态学表明,模型组小鼠海马神经元有明显损伤,表现为海马CA1区神经元尼氏小体蓝色颗粒减少和胞浆空泡样变性,平均积分光密度值显著低于对照组小鼠（P＜0.01）,ERT组小鼠海马CA1区尼氏小体增多,平均积分光密度值升高大于模型组小鼠（P＜0.05）,表明雌激素可对抗D-半乳糖所致的神经元损伤。5.免疫组织化学及western blotting结果显示,模型组小鼠海马神经元DNA明显受损,海马CA1区DNA氧化损伤标志物8-oxox-dG阳性细胞数显著高于对照组小鼠（P＜0.01）,而DNA损伤碱基切除修复蛋白MTH1及促DNA修复蛋白BDNF的表达均明显降低（P＜0.01）;ERT组小鼠CA1区8-oxox-dG阳性细胞数明显减少,MTH1及BDNF的表达明显回升（P＜0.05）。同时,ERT组小鼠应激诱导的促DNA修复蛋白Hsp70的表达亦显著高于模型组（P＜0.01）,表明雌激素可通过调节DNA修复机制来减少DNA氧化损伤。6.末次注射BrdU后24h,模型小鼠海马DG区BrdU阳性细胞数较对照组显著减少（P＜0.01）,ERT组小鼠BrdU阳性细胞数明显多于模型组（P＜0.05）,表明雌激素可保护小鼠海马区神经干细胞的增殖,有利于衰老细胞更新,延缓组织老化。7.利用形态学及RT-PCR的方法,观察小鼠子宫的相关变化,发现模型组小鼠子宫显著萎缩,E2补充后子宫重量增加,但子宫内膜癌标志物MN/CA9 mRNA的表达在各组小鼠均未检测到。表明在本实验条件下雌激素使用在保护神经元的同时未使子宫产生异常变化。本部分研究结果显示,雌激素可通过减少内源性活性氧产物的生成,调控DNA损伤修复蛋白表达,减轻DNA氧化损伤,促进其损伤修复,从而减少由损伤DNA积累所启动的衰老程序而发挥延缓衰老作用。第二部分植物雌激素α-玉米赤霉烯醇对PC12细胞Aβ_25-35损伤的保护作用研究1.培养PC12细胞,采用MTT方法观察到,5μM Aβ_25—35与细胞共孵育24h,活细胞数显著低于对照组（P＜0.01）;而将细胞与不同浓度E2或α-ZAL预孵育12h后再加入Aβ_25—35,活细胞数呈剂量依赖性的升高（P＜0.05）,但在相同浓度下α-ZAL的细胞保护效应略低于E2。2.透射电镜结果显示,5μM Aβ_25—35与PC12细胞共孵育24h可导致细胞凋亡。Hoechest33258荧光染色实验结果显示,Aβ_25—35作用组凋亡细胞数显著多于对照组（P＜0.01）,E2及α-ZAL预孵育均明显减轻Aβ_25—35诱导的细胞凋亡（P＜0.05）。3.生化学检测结果提示,与对照组相比,单独Aβ_25—35与PC12细胞共孵育,细胞MDA含量升高（P＜0.01）,SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.01）,而E2及α-ZAL预孵育均能有效对抗Aβ_25—35所致的细胞抗氧化酶活性降低及MDA生成增多（P＜0.01）,表明E2及α-ZAL可明显对抗Aβ_25—35导致的细胞氧化损伤。4.Western blotting及RT-PCR实验结果显示,Aβ_25—35导致PC12细胞抗凋亡蛋白bcl-2表达减少,而促凋亡蛋白bax及caspase-3表达升高,E2及α-ZAL可拮抗上述改变。同时E2及α-ZAL还能诱导抗凋亡基因A20 mRNA的表达,表明E2及α-ZAL可通过调控凋亡相关蛋白及基因的表达而发挥抗细胞凋亡作用。本部分研究结果显示,E2及α-ZAL均可通过对抗氧化损伤,调控凋亡相关蛋白的表达而发挥抗Aβ_25-35诱导的细胞凋亡效应,α-ZAL的细胞保护效应稍弱于E2。