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蛇毒中含有较多的影响血液系统功能的活性组分,如:凝血酶样酶、解离素、纤溶酶、纤溶酶原激活剂、凝血Ⅹ因子激活剂等,特别是在蝮科和蝰科蛇毒中尤为突出。1993年,中科院昆明动物研究所的张云等[1]首先报道从竹叶青蛇(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒中分离纯化出具有激活纤溶酶原作用的蛋白酶(TSV-PA),并对TSV-PA的大量后续研究,为新型溶栓药物的开发提供了新的思路。本实验室已成功从江浙短尾蝮(Gloydius brevicaudus)蛇毒中分离纯化出短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂(plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom, GBV-PA),并通过动物实验发现它对动物实验性血栓具有治疗和预防作用。为了全面了解GBV-PA的药理学特点,本课题拟研究GBV-PA对动物凝血系统的影响和并观察其一般药理学作用,为进一步的开发研究提供资料。1. GBV-PA的分离纯化及部分理化性质测定1.1 GBV-PA的分离纯化短尾蝮蛇粗蛇毒用苯甲脒-琼脂糖凝胶(Benzamide SepharoseTM 4 Fast Flow)亲和层析,得到两个蛋白峰,收集具有酶活性的第二峰,经浓缩后再用Superdex G-30凝胶过滤层析进一步纯化,得到2个蛋白峰,纤维蛋白平板法鉴定第Ⅱ峰的降支具有激活纤溶酶原,间接溶解纤维蛋白的作用,该组分再过Lichrospher C18 4.6/250反相色谱柱,得到2个蛋白峰,经纤维蛋白平板法鉴定得到第Ⅱ峰具有间接溶解纤维蛋白作用,既GBV-PA。1.2 GBV-PA的理化性质GBV-PA经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),在β-巯基乙醇还原和非还原条件下,均显示单一条带,即其为单一肽链的蛋白质,分子量为40kDa左右。1.3 GBV-PA对小鼠的急性毒性按照化学药物急性毒性试验技术指导原则测定GBV-PA对小鼠的急性毒性。做了一个初始剂量360μg.kg-1小鼠预试验,观察期内小鼠不出现急性毒性,以2倍的倍数递增剂量,128倍剂量时小鼠仍不出现急性毒性。给予小鼠最大给药浓度、最大给药体积剂量,进行最大耐受量(Maximal tolerance dose, MTD)实验,小鼠未见其他异常反应。表明GBV-PA静脉注射给药不能获得对小鼠的LD50,单次给药也无明显毒性反应。2. GBV-PA对家兔凝血功能的影响取健康家兔30只,雌雄各半,随机分为5组即:GBV-PA 75μg.kg-1、150μg.kg-1、300μg.kg-1、生理盐水阴性对照组和UK阳性对照组。分别于用药前,用药后60min取血2ml,以3.8%枸橼酸钠(9:1)抗凝。制备贫血小板血浆(PPP),测定兔血浆的PT、APTT、TT及凝血时间CT。结果家兔静脉注射不同剂量的GBV-PA后,家兔的凝血时间CT从原来的108s左右延长到120s~158s,家兔的APTT从原来的40s左右延长到68s~153s,家兔的PT从原来的16s左右延长到48s~93s,TT则从原来的20s左右延长到98s~150s,并且呈现一定的剂量依赖性。3.GBV-PA对动物循环、呼吸和中枢神经系统功能的影响3.1 GBV-PA对小鼠神经系统的影响观察GBV-PA对小鼠自主行为活动、自发活动、协调运动和阀下戊巴比妥钠催眠实验的影响。结果小鼠静脉注射GBV-PA90、360和720μg.kg-1后,与NS组比较,小鼠自主行为活动基本正常;与NS组比较, GBV-PA对小鼠自发活动次数影响无显著性差异(p>0.05);与NS对照组和氯丙嗪阳性对照组比较,GBV-PA对小鼠的协调运动无影响;与安定阳性对照组和空白对照组比较,GBV-PA对各剂量组小鼠阈下剂量戊巴比妥钠催眠亦无协同作用;表明静脉注射GBV-PA90、360和720μg.kg-1对小鼠的神经系统和精神系统均无明显影响。3.2 GBV-PA对大鼠血压和心率的影响采用多导生物信号记录仪观察记录麻醉大鼠给药前后收缩压(SAP)、舒张压(DAP)、心率(HR)的变化。结果与NS对照组相比,静脉注射GBV-PA90、360、720μg.kg-1后大鼠的SAP、DAP、MAP和HR变化无显著性差异。3.3 GBV-PA对麻醉大鼠呼吸功能的影响将张力传感器用手术线连接并固定于动物剑突皮肤处,信号连接于多导生物信号记录仪,测定麻醉大鼠给药前后的呼吸频率和呼吸幅度,同时用Ⅱ导联心电电极测定大鼠的心电图。结果与NS对照组相比,静脉注射GBV-PA 75、150和300μg.kg-1对大鼠呼吸频率和呼吸幅度和心电图无明显影响。结论:小鼠静脉注射GBV-PA 46mg/kg未见明显毒性;家兔iv GBV-PA 75、150和300μg.kg-1血浆的PT、APTT、TT、CT显著延长,呈现一定的剂量依赖性;静脉注射GBV-PA 90、360和720μg.kg-1对小鼠的自发活动、自主行为活动、协调运动等神经和精神系统活动无明显影响;大鼠iv 75、150和300μg.kg-1对血压、心率、呼吸频率和呼吸幅度亦无明显影响。