骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种全身性骨代谢疾病,在中国慢性病中发病率第三,其特征在于骨量和微结构的全身性损伤,导致脆性骨折。OP主要分为原发性OP、继发性OP以及特发性OP,其中原发性OP发病率最高。原发性OP主要是由于衰老以及骨组织功能退化以及性激素分泌减少引发的。原发性OP又分为绝经后OP(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)和老年OP,由于女性发病率远高于男性,因此对于PMOP的治疗成为研究的热点。研究认为雌激素水平下降引起的氧化应激是绝经后OP发生的重要原因。体内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平过高,可导致线粒体肿胀,线粒体膜通透性增加,功能降低,从而进一步加剧ROS产生,诱导细胞凋亡。成骨细胞(Osteoblasts,OBs)是参与骨骼形成的主要细胞,在绝经后会过度凋亡影响骨骼修复,导致PMOP。中医药治疗PMOP主要以滋补肝肾、养肾健脾、活血化瘀为主。当归芍药散(Danggui Shaoyao San,DSS)是治疗PMOP的有效方之一。白芍是DSS中的君药,具有补血、柔肝、滋阴等作用,也是组成治疗OP中药复方制剂的重要单味药之一,其使用频率可达约1/3。白芍的主要化学成分是萜类和酚类化合物。白芍治疗OP活性成分的研究主要围绕芍药苷等萜类化合物,并已获得证实。而以 1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4-6-pentyl-O-galloyl-beta-D-glucose,PGG)为代表的具有强抗氧化性的酚类活性成分尚未获得重视。已有研究表明,酚类化合物可促进OBs增殖、分化,具有骨保护作用,并且该作用可能与其抗氧化特性有关。然而,PGG是否具有保护作用尚未见报道。本文旨在观察PGG是否具有骨保护作用,并进一步探讨其在氧化应激环境下对OBs的作用及其与雌激素受体(Estrogen receptor,ER)之间的关系。本课题围绕以下几点进行研究:1.PGG对斑马鱼骨形成抑制模型的干预作用采用泼尼松龙(Prednisolone,Pred)诱导的斑马鱼幼鱼骨形成抑制模型来检测PGG对斑马鱼骨形成的影响。具体的实验分组如下:空白对照组(Control组),25 μtmol·L-1 Pred模型组,10-8 mol·L-1 17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)阳性药组、10-10、10-9、10-8 mol.L-1 PGG 组。将受精后3天(Days post fertilization,dpf)斑马鱼进行Pred造模2天,随后给药4天。钙黄绿素染色结果显示,模型组斑马鱼椎骨数目显著降低,给予E2和10-9、10-8 mol.L-1 PGG后斑马鱼骨量显著提高。2.PGG对成骨细胞分化的影响OBs分化实验采用前成骨细胞系MC3T3-E1细胞及骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),将细胞种入24孔板,待长满后用成骨分化液进行刺激分化。碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)染色及ALP活力检测结果显示,PGG在MC3T3-E1细胞分化第3天时可显著促进ALP的表达,提高ALP的酶活力。茜素红染色结果显示,在分化第14天,PGG显著促进MC3T3-E1细胞及BMSCs钙化结节的形成;qRT-PCR结果显示PGG可显著促进OBs分化指标ALP、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、Runt相关转录因子 2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)mRNA 水平的表达。3.PGG对氧化应激状态下成骨细胞的影响体外采用过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)构建氧化应激模型,观察PGG对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞的凋亡及线粒体功能的影响。MTT、Western blot、PI/Annexin V-FITC流式细胞技术检测结果显示,PGG可显著提高细胞存活率,抑制细胞凋亡。此外,JC-1细胞流式及荧光染色实验结果显示PGG可显著提高H202诱导的MC3T3-E1细胞的线粒体功能的重要指标线粒体膜电位。ATP试剂盒检测结果显示PGG可显著促进H202诱导的MC3T3-E1细胞的ATP的生成。DCFH-DA荧光染色及流式细胞术检测发现,PGG可显著降低 MC3T3-E1 细胞内的 ROS 水平。核因子 E2 相关因子 2(Nuclear factorerythroid-2-related factor 2,Nrf2)是抗氧化的重要信号通路,能调控下游多种抗氧化酶表达,如血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)。免疫荧光及Western blot实验结果显示PGG可以促进Nrf2入核,并且可上调HO-1蛋白的表达。4.PGG的骨保护作用的机制探讨(1)PGG抗成骨细胞凋亡及恢复线粒体功能的作用与ER之间的关系。PI/Annexin V-FITC流式细胞技术检测结果显示,PGG可显著抑制H2O2诱导的OBs的凋亡;加入核雌激素受体(Nuclear estrogen receptor,nER)非特异性拮抗剂ICI182780、膜雌激素受体(Membrane estrogen receptor,mER)GPR30特异性拮抗剂G15以及另一种膜雌激素受体ER-α36特异性拮抗剂SNG1153后,结果发现ICI182780可以逆转PGG抗H2O2诱导的OBs凋亡的作用,而G15和SNG1153无明显逆转作用。此外,细胞流式结果及荧光拍照结果进一步证实,ICI182780可以逆转PGG清除细胞内ROS、提高线粒体膜电位以及促进Nrf2入核的作用。(2)PGG促成骨细胞分化的作用与ER之间的关系。茜素红染色结果显示,PGG可以显著促进OBs的钙化结节的产生,加入各种ER拮抗剂后,ICI182780可逆转该作用。此外,加入核雌激素受体ER-α特异性拮抗剂MPP以及ER-β特异性拮抗剂PHTPP,结果发现MPP可显著逆转PGG促OBs的作用,但PHTPP无明显逆转作用。(3)PGG与ER之间的作用模式。分子对接结果显示PGG可以有效进入ER-α的活性口袋,结合位点位于Met343、Thr347、Ala350以及Va1534,但PGG却不能进入ER-β的活性口袋。分子动力学结果进一步显示,PGG与ER-α的结合自由能为-201.40±5.13 kcal-mol-1,蛋白质均方根差(Root-mean-aquare-deviation,RMSD)值在100 ns内收敛至2.5A,大多数均方根涨落(Root-mean-aquare-fluctuation,RMSF)值均小于1.0A,形成的氢键数均高于4。研究结论:(1)体内实验结果表明PGG可以显著增加Pred诱导的斑马鱼骨形成抑制模型的骨量;体外实验结果显示PGG可以促进OBs分化。以上结果表明PGG具有促进骨形成的作用。(2)PGG可以提高氧化应激状态下OBs的细胞活力并且可抗其凋亡。(3)PGG可能通过恢复线粒体功能从而发挥抗OBs凋亡的作用,并且该作用可能与促进抗氧化转录因子Nrf2入核有关。(4)nER非特异性拮抗剂ICI182780可以逆转PGG的促骨形成、抗OBs凋亡的作用,这提示PGG的骨保护作用可能与nER有关。(5)分子对接及分子动力学结果显示PGG可以与ER-α结合,无法与ER-β结合,因此,PGG可能是通过与ER-α结合发挥骨保护作用。综上所述,体内外实验证明PGG可促进骨形成,具有骨保护作用,并且PGG在氧化应激状态下抗成骨细胞凋亡,该作用可能与改善线粒体功能有关。进一步研究发现,PGG的促骨形成、抗OBs凋亡可能与ER-α有关。本研究为临床应用PGG治疗PMOP提供了依据,为PMOP治疗药物发现提供了新思路。