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动物实验研究表明；AF2364是一种很有潜力的男性避孕药候选化合物。这一化合物通过干扰精子细胞与支持细胞间的黏附功能,可逆地诱导精母细胞以及精细胞从生精上皮丢失,但不影响精原细胞,从而导致给药大鼠不育。一旦药物代谢完成,精原细胞可重新开始精子发生,动物即可恢复生育能力。AF2364能引起细胞骨架肌动蛋白的聚集和解聚,导致支持细胞与精子细胞间黏附功能降低,最后使未成熟精母细胞和精子细胞从生精上皮丢失。然而AF2364对人类精子的作用尚未了解,探索AF2364在人类精子中的作用及其分子机制,对开发新一代男性避孕药具有重要意义。
目的:
研究AF2364对精子的抑制作用及其作用机制。
方法：
1.精子的处理
精子与预温HTF培养基等量混匀后,500g离心15min,弃去上清,精子用2ml的HTF进行悬浮:精子悬液再用45％和90％Percoll间断密度梯度离心(600g,15 min),所得下层活力较好精子再用约10倍HTF悬浮,300g离心5 min。弃去上清液,再用HTF调整精子密度到2-3x107 cells/ml。
1.金霉素染色法评价AF2364对精子获能和顶体反应的影响
处理好的精子进行分组,加入不同浓度的AF2364(0,10nM,100nM,1μM,10μM),以及孕酮,随后精子于37℃进行获能培养4-5h,然后,分别加入等体积溶剂(作为对照)、并采用CTC染色法(金霉素染色法)评价精子获能情况。另外,在精子获能培养5小时后,加入不同浓度的AF2364(0,10nM,100nM,1μM,10μM),继续培养30min,然后,加入15μM P4(或2μg/ml rhuZP3β),诱发精子AR,15min,用CTC染色法评价顶体反应率。
2.卵子的处理
选用8-10周龄的叙利亚金黄地鼠,阴道涂片观察,判断发情周期,之后注射超排卵激素,通过解剖取出输卵管中的卵子。将卵子存放在HTF培养基中,加入透明质酸酶(2.5mg/ml)去除卵丘细胞,用培养基洗3次,再在胰酶(2.5mg/ml)的作用下,将卵子透明带去除,并重复用培养基洗3次,放入2℃冰箱保存备用。
3.精子穿卵实验评价AF2364对精子受精能力的影响
处理好的精子加入10μM的AF2364,孕酮和空白对照,于37℃进行获能培养4-5h,将精子和卵子共培养3小时后,显微镜下观察精子穿透卵子率(PR),以及精子穿卵指数(PI)。
4.计算机辅助精液分析系统(CASA)评价AF2364对精子活力和精子超激活运动的影响
处理好的精子加入10μM的AF2364,孕酮和空白对照,于37℃进行获能培养4-5h,放入到10 mm×10 mm,深度20μm特定的载玻片上,通过计算机对精子的捕捉,随机选择10个区段,在60赫兹下分析精子活力,以及超激活运动参数。
5.AF2364对Forskolin激动的精子获能过程的影响
精子获能培养前,分成6组:阳性对照(孕酮),阴性对照(空白),Forskolin,Forskolin+孕酮,AF2364+Forskolin,AF2364+Forskolin+咖啡因,获能培养5小时后,CTC染色,比较精子的获能情况。
6.AF2364在缺氯培养基中对精子获能的影响
精子培养在缺氯的培养基中,分成空白,孕酮和AF2364三组,获能培养5小时,CTC染色,观察精子的获能情况以及自发性顶体反应情况。
7.酶免疫法测定AF2364作用下获能精子的cAMP含量
AF2364和对照组精子经过获能培养后,固定,提取cAMP,标准品以及样品加入到96孔中,通过与一抗,二抗结合,以及显色剂的作用下,放入到酶标仪中,读取吸光度,画出标准曲线,比较AF2364组和对照组的cAMP含量差异。
结果：
通过CTC染色法,SPA以及CASA实验,我们确定了AF2364抑制人类精子获能和受精的作用。CTC染色法实验结果表明,AF2364对人类精子获能及其顶体反应具有明显的抑制效果,并且对精子获能的抑制作用具有可逆性。SPA实验证明了AF2364在精子穿透卵子环节,具有显著的抑制作用,模拟了精子受精过程,评价了AF2364对精子受精能力的抑制效果。精子的CASA测试,发现AF2364不影响精子的活动能力,但是对精子的超激活运动有明显抑制效果,超激活运动的相关参数与对照组有着较大差异,精子超激活率也明显下降。在设计了Forskolin以及缺氯培养的两组实验之后,我们初步推断,AF2364是通过干扰囊性纤维跨膜传导调节因子(CFTR)活性,抑制环腺苷酸的生成从而抑制精子获能和顶体反应,进而抑制精子的受精能力。在通过EIA法测精子胞内cAMP含量,我们更加肯定了AF2364对精子抑制作用的分子机制。
结论：
AF2364抑制精子的获能,顶体反应,超激活运动以及受精能力,但是不影响精子的活力。并且初步了解了AF2364的抑制作用是通过抑制CFTR的功能得以实现的。