论文部分内容阅读
结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,目前的治疗方法手术结合放化疗并不能完全解决转移和复发,而免疫治疗通过提高机体的免疫力诱导针对肿瘤的特异性杀伤效应,有望弥补目前治疗方法的不足。树突状细胞(Dendritic cell, DC)作为最有效的专职抗原提呈细胞在免疫治疗中占有核心地位。我们之前的研究证实作为预防性应用,DC肿瘤疫苗对肿瘤的生长具有明显的抑制作用,并且TLR配体能够有效的促进DC成熟；但是作为治疗性应用,DC肿瘤疫苗的疗效尚不理想。近来有研究发现NKT细胞能增强DC的抗肿瘤效应,因此,我们设想通过激活NKT细胞来增强肿瘤疫苗疗效。由于NKT细胞仅能识别由CDld分子提呈的糖脂类,本研究首先构建了表达CDld的MC38小鼠结肠癌细胞系,并加载糖脂类制备了肿瘤细胞/糖脂类复合物,后者与TLR配体联合制成新型肿瘤疫苗,再通过尾静脉注射免疫小鼠,观察其对NKT细胞和DC功能的影响。第一部分制备肿瘤细胞/糖脂类复合物目的构建表达CDld的MC38小鼠结肠癌细胞系(CDld-MC38),并验证其能否与糖脂类α-GC稳定结合,以及结合的最佳条件。方法运用慢病毒法(GFP-FLAG-CDld)转染MC38细胞,通过流式细胞术对转染后的细胞进行筛选；采用荧光显微镜观察、Western blot检测以及流式细胞术对筛选出的转基因细胞CDld分子的表达情况进行验证；通过结合力实验探讨CDld-MC38能否与a-GC稳定结合以及结合的最佳浓度和时间。结果荧光显微镜下直接观察,CDld-MC38绿色荧光阳性细胞每个高倍镜视野计数(38.54±1.30),明显高于MC38细胞(0±0),两组间存在统计学差异(P<0.001); Western blot结果显示,CDld-MC38具有明显的FLAG标签蛋白表达,而MC38不表达FLAG标签蛋白；流式细胞术检测MC38细胞CDld阳性率为(0±0)%,而CDld-MC38细胞CDld阳性率为(98.10±2.53)%,两组间存在明显统计学差异(P<0.001)；CDld-MC38加载500ng/ml α-GC24h后,CDld:α-GC结合率为(12.11±2.15)%,48h后,结合率为(67.74±5.82)%；加载1μg/mlα-GC24h后,CDld:α-GC结合率为(21.07±3.48)%,48h后,结合率为(75.58±6.35)%；48h500ng/ml组与24h组相比P<0.01,48h lμg/ml与24h组相比P<0.01,48h500ng/ml组与48h lμg/ml相比P>0.05。结论成功构建表达CD1d的MC38小鼠结肠癌细胞系(CDld-MC38);并且能与a-GC稳定结合,两者在a-GC给药浓度为1μg/ml和作用时间48h时结合效果最佳。第二部分肿瘤细胞/糖脂类复合物联合TLR配体(肿瘤疫苗)对小鼠NKT细胞和DC功能的影响目的研究肿瘤疫苗对小鼠体内NKT细胞和DC功能的影响。方法将C57BL/6小鼠分为五组,分别尾静脉注射PBS、α-GC、TLR9配体、CDld-MC38/α-GC复合物和CDld-MC38/α-GC复合物+TLR9配体后：(1)分离肝脏单个核细胞,流式检测NKT细胞表面CD69和CD40L表达水平以及胞内IFN-γ分泌情况；(2)分离脾脏淋巴细胞,流式检测DC表面CD86和CD40表达水平；(3)收集血清检测Th1/Th2型细胞因子分泌情况。结果实验组NKT细胞CD69表达率与a-GC组无明显统计学差异(P>0.05),与其他三组相比明显升高,存在统计学差异(P<0.01或P<0.05)；实验组NKT细胞CD40L表达率明显升高,与各组存在统计学差异(P<0.01)；实验组NKT细胞内IFN-γ阳性率与a-GC组无明显统计学差异(P>0.05),与其他三组相比明显升高,存在统计学差异(P<0.01或P<0.05)；实验组DC CD86表达率与a-GC组无明显统计学差异(P>0.05),与其他三组相比明显升高,存在统计学差异(P<0.01)；实验组DCCD40表达率与其他组相比明显升高,存在统计学差异(P<0.01)；实验组小鼠血清IL-2浓度明显升高,各时间点与其他组相比均具有统计学差异(P<0.01),且2h后达高峰；实验组血清TNF-α浓度与α-GC组相比无统计学差异(P>0.05),与其他三组相比明显升高,各时间点均具有明显统计学差异(P<0.01),且2h达高峰；实验组血清IFN-γ浓度与PBS组、TLR9配体组和CDld-MC38/α-GC复合物组相比明显升高,各时间点均具有统计学差异(P<0.01或P<0.05)；a-GC组与PBS组相比,血清IL-4浓度明显升高(P<0.01),2h后浓度达到高峰,实验组仅2h时血清IL-4浓度与PBS组相比有所升高(P<0.05),其他时间点与其他组相比均无明显统计学差异(P>0.05)。结论肿瘤疫苗能促进NKT细胞和DC成熟,并增强其功能；增加血清中Thl型细胞因子(IL-2、TNF-α和IFN-γ)分泌,但对Th2型细胞因子(IL-4)分泌无明显影响。