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目的： 建立和评价小剂量环孢霉素(CsA,3mg/kg/d) 免疫抑制下的肾脏缺血／再灌注大鼠模型。 观察小剂量免疫抑制肾脏缺血／再灌注模型中，外源性锌诱导肾脏、胸腺、脾脏金属硫蛋白 (Metallothionein,MT)表达的方式和差异性。 在肾脏缺血／再灌注模型中，探讨外源性金属硫蛋白对缺血／再灌注肾脏损伤的保护作用、对免疫系统的影响，并观察与小剂量环孢霉素之间的相互作用。 方法： 1．应用小剂量环孢霉素建立大鼠肾脏免疫抑制缺血／再灌注模型，光镜和电镜下观察肾脏组织学改变，检测肾功能指标肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及过氧化物损伤指标超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量并观察时程变化。 2．对小剂量CsA免疫抑制下的肾脏缺血／再灌注大鼠模型，腹腔注射氯化锌，采用竞争性ELISA检测肾脏、脾脏、胸腺的MT含量；并采用荧光实时定量RT-PCR检测肾脏MT-mRNA，观察MT的动态表达。 3．对肾脏缺血／再灌注大鼠模型，给予外源性MT和／或小剂量CsA，光镜和电镜下观察肾脏组织形态学变化，检测肾功能及过氧化物含量的变化，并采用TUNEL原位染色法观察肾脏细胞凋亡，BrdU(+)细胞计数观察肾小管增生情况。 4．分离全血淋巴细胞，进行体内组的ConA刺激T淋巴细胞增殖试验，并进行MT和／或小剂量CsA的体外组的ConA刺激T淋巴细胞增殖试验。采用PE标记CD4~+、FITC标记CD8~+单克隆抗体在流式细胞仪(FCM)上进行T淋巴细胞CD亚群测定。用ELISA方法检测血清细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ,的含量。采用TUNEL原位染色法观察脾脏、胸腺的凋亡。复月大学博十论文:金属硫蛋白保护肾脏缺血/再灌注损伤及对免疫系统的影响中文摘要结果: 成功地建立了在小剂量CsA进行免疫抑制下的缺血/再灌注肾脏大鼠模型。 小剂量CSA免疫抑制下，缺血/再灌注组的光镜和电镜下肾脏组织学改变、 肾功能指标升高、SOD消耗、MDA升高程度均比假手术对照组严重，并有 显著差异。小剂量CSA免疫抑制下肾肌缺血/再灌注组在术后第24小时损伤 最严重，可作为以后的实验部分观察时间点选择为第24小时的依据。2.小剂量CsA免疫抑制缺血/再灌注肾脏大鼠模型中，Zn诱导缺血/再灌注肾脏 表达的MT主要分布在近曲小管、远曲小管，而肾小球部位较少。Zn诱导的 肾脏MT含量在缺血/再灌注手术后6小时即出现显著升高，第24小时达到 最高，而后逐渐降低。Zn诱导组的肾脏表达MT水平术后各时间点均高于 NaCI对照组并有显著差异。MTI一mRNA、MTZ一mRNA则在术后6小时表达 最高。 Zn诱导组脾脏和胸腺的MT含量在术后6小时、24小时、72小时均比NaCI对照组高且有显著差异，时程变化和肾脏MT含量变化相似，6小时即出现显著升高，第24小时达到最高峰，而后逐渐降低。3.在缺血再灌注肾脏模型中，外源性MT组的肾功能损伤、自由基损害均比 CsA组、NaCI对照组显著减轻。MT组的肾脏细胞凋亡指数均低于CsA组、 NaCI对照组并均有显著差异。MT组的肾小管BrdU(+)细胞计数均高于CsA 组、NaCI对照组并有显著差异。 CsA组肾功能损伤、自由基损害均比NaCI对照组显著减轻，但均比MT组严重且‘有显著差异。CsA组的肾脏细胞凋亡指数比NaCI对照组低并有显著差异，但高于MT组并有显著差异。CsA组肾小管BrdU(+)细胞计数比NaCI对照组高且有显著差异，但比MT组低并有显著差异。 联合应用MT+CsA组的肌醉、尿素氮改善最明显，和单纯MT组、CsA组、NaCI组比较均有显著性差异。MT+CsA组的光镜和电镜下组织形态学改变最轻。MT十CsA组的过氧化物指标(S OD、MDA)改善程度与MT组 第2页象复日.大学博十论文:金属硫蛋白保护肾脏缺血/再灌注损伤及对免疫系统的影响中文摘要相似，比CsA组、NaCI组好且差异有显著性，但与MT组差异无显著性。MT+CsA组和MT组肾脏细胞凋亡指数相似，均为最低，与单纯CsA组、NaCI组比较差异均有显著性。MT+CsA组的肾小管细胞Brdu(+)细胞计数较高，和MT组相近，但与单纯CsA组、NaCI组比较差异均有显著性。4.在缺血再灌注肾脏模型中，和NaCI组比较，MT可显著升高淋巴细胞增殖能 力、IL一2与IFN一了分泌量、cD4十T淋巴细胞数和cD4+/C DS+比值，而IL一4、 CDS+T淋巴细胞数稍下降但差异未达显著意义。和MT组、NaCI组比较， CsA组的淋巴细胞增殖能力、细胞因子水平、循环血T淋巴细胞CD亚群均 明显受抑制。与MT组比较，同时合用MT+CsA组能明显降低淋巴细胞增殖能力、细胞因子水平、循环血T淋巴细胞CD亚群计数，差异均有极显著性。 ConA刺激的淋巴细胞增殖试验结果表明，体内和体外MT+CsA组的淋巴细胞增殖cPm值均数都比相应体内/体外csA组高、比NaCI组低。统计学上进行两两比较时，体内MT+CsA组与体内CsA组、NaCI组比较均无显著差异;体外MT十CsA组与NaCI比较无显著差异，但与体外CsA组比较却存在显著性差异。 与CsA组比较，同时注射MT十CsA组的IL一2、IFN一表达水平稍高，IL一4表达稍低，差异均有显著性