论文部分内容阅读
研究背景:目前,肺癌的受体显像与治疗越来越受到青睐。EGFR靶点备受关注,包括非小细胞肺癌在内的绝大多数肿瘤细胞均过表达EGFR[1],EGFR在细胞的增殖和信号的传导中扮演着重要角色,故其已成为国内外肿瘤分子受体显像与靶向治疗研究的重要靶点。目前,针对EGFR受体显像与治疗研究的靶向药物主要有EGFR-TKI、单克隆抗体以及多肽。较EGFR-TKI和单抗而言,多肽拥有其独有的优势:对靶蛋白的亲和性较高、血液中清除速度较快、免疫源性较低、容易合成和修饰等。新型小分子多肽GE11由12个氨基酸组成。它是通过噬菌体肽库筛选技术获得的。研究表明,GE11可以与EGFR特异性结合,并高效靶向EGFR。GE11作为靶向EGFR受体的载体,已经得到了较多的应用,并且在治疗NSCLC裸鼠荷瘤模型实验中有显著疗效。但是,通过核素标记小分子多肽GE11,以达到分子显像和治疗目的的研究在国内外均无相关报道。目的:本研究拟用99mTc标记小分子多肽GE11制备靶向EGFR的小分子核素分子探针,鉴定其理化性质,并探讨其在裸鼠体内生物分布及裸鼠体内显像的情况,旨在进一步为肺腺癌患者的早期诊治提供实验基础。方法:1.99mTc-GE11的制备:委托江苏强耀生物有限公司采用化学方法人工合成含有BCFR的多肽GE11,采用氯化亚锡还原法对其进行99m9m Tc标记。然后采用TCL法测定标记率,并摸索标记条件以使标记率最高。并将100?l反应后混合液上Sephadex G50柱纯化。2.99mTc-GE11理化性质的鉴定:分别通过常温下放置不同时间点、人血浆蛋白实验、高压液相色谱实验来测定其体外稳定性、其与血浆蛋白的结合量以及分析多肽的成分是否单一。然后分别用脂水分配实验及半胱氨酸实验来分析99mTc-GE11的亲水脂性及与99m9m Tc螯合的稳定性。3.99mTc-GE11与A545细胞的特异性结合能力鉴定:用体外细胞实验来验证99mTc-GE11与A549细胞的特异性结合能力。4.99mTc-GE11在正常裸鼠的体内生物分布及SPECT显像:经尾静脉注射100?l新鲜99mTc-GE11（7.4MBq）,分别于注射后不同时间点将裸鼠采用颈椎脱臼法处死,取各组织器官进行称量,并用γ-免疫计数仪测定其放射性计数,结果经参考源矫正后计算它们的每克组织百分注射剂量率（%ID/g）。采用SPECT观察经尾静脉注射新鲜99mTc-GE11后在体内的分布情况。5.99mTc-GE11在荷人肺腺癌（A549）裸鼠模型的体内生物分布及SPECT显像:构建荷人肺腺癌（A549）裸鼠模型,待肿块体积大于1cm3后,即可以用于99mTc-GE11的体内分布及SPECT显像研究。采用体内分布实验检测各器官的放射性计数（cpm）,然后计算它们的%ID/g。采用SPECT静态显像观察注射99mTc-GE11后不同时间点在体内的显像情况,显像结束后,使用感兴趣区技术计算肿瘤部位与对侧相应部位的放射性比值,并对肿瘤/非肿瘤（T/NT）放射性比值进行半定量分析。结果1.成功用NaTcO4对GE11进行了标记,标记率为（93.12±0.83）%,比活度为（26.19±0.42）TBq/mmol,纯化后的放化纯度为（93.64±0.56）%。2.99mTc-GE11理化性质的鉴定:99mTc-GE11溶液体外室温放置6h、12h后,其标记率仅下降了2.14%、3.11%;99mTc-GE11与血浆蛋白结合率为4.8%;与不同浓度半胱氨酸37℃温育1 h后,未结合99m9m Tc含量无明显变化;脂/水分配系数为lgP=-1.87±0.05。3.细胞实验结果显示:实验组A549细胞表面的放射性随着99mTc-GE11浓度的增加而升高,并逐渐趋于饱和;对照组随着99mTc-GE11浓度的增加,放射性计数逐步升高,但无饱和趋势,且其放射性远低于实验组。4.99mTc-GE11在正常裸鼠的体内生物分布实验显示:99mTc-GE11在血液、肾脏中的放射性清除迅速,在肺、骨骼、肌肉等组织中表现为较低放射性摄取,在脑中表现为持续性低放射性摄取,99m9m Tc-GE11主要通过泌尿系统排泄,其次是肝胆系统。5.99mTc-GE11在荷人肺腺癌（A549）裸鼠模型的体内生物分布及SPECT显像显示:99mTc-GE11在肺部表现为较低放射性摄取,在血液、肾脏中的放射性清除迅速,肿瘤组织可以选择性浓聚99mTc-GE11,在注射1.0h时,肿瘤/肌肉比值达到最大（12.94±2.65）,且肿瘤组织显影最清晰。结论1.放射性核素99mTc能对多肽GE11进行标记,标记方法可靠,且标记率高。2.标记多肽99mTc-GE11体外稳定性较好,与血浆蛋白结合率较低,99mTc与GE11螯合牢固。3.99mTc-GE11可以与A549细胞特异性结合。4.99mTc-GE11进入肿瘤的时间早,肿瘤与非肿瘤的放射性比值较高,体内清除速度快,因此,99mTc-GE11作为靶向EGFR的核素分子探针有潜力成为一种诊疗肺癌的新型靶向显像剂,也为我们以后从基础研究转化成临床应用奠定了实验基础。