姜黄(Curcuma longa L.)属姜科姜黄属多年生草本植物,广泛存在于热带、亚热带地区。其中姜黄素是从姜黄根茎中提取的脂溶性酚类色素,可作为天然的食品添加剂,也是主要的活性成分,具有多种药理活性,如抗炎、抗肿瘤、抗氧化、维护肾和肝的功能等,已成为国内外研究的热点。目前多集中于研究姜黄素的提取工艺和药理活性方面,而姜黄素生物合成途径中的一些关键酶基因尚未得到分离。肉桂酸-4-羟化酶(C4H)是姜黄素生物合成途径中的一个关键酶,位于苯丙烷代谢途径的分支点,负责催化反式肉桂酸催化生成对香豆酸。二酮辅酶A合成酶(DCS)位于姜黄素合成途径的末端,催化阿魏酸辅酶A和丙二酰辅酶A合成阿魏酸二酮辅酶A酯从而进一步催化生成姜黄素。本研究采用RACE技术首次从姜黄中克隆得到C4H基因序列,并采用同源克隆法扩增得到了DCS基因的CDS区序列,并采用荧光实时定量PCR利用技术(qRT-PCR)分析C4H、DCS基因在姜黄不同组织部位、分别添加不同浓度NaCl和SNP溶液处理的表达模式。最后将获得的CURS基因的植物表达载体通过农杆菌转化法侵染烟草叶片从而获得转基因烟草植株。本论文研究成果如下:1、通过同源克隆法扩增得到1173 bp的姜黄DCS基因的CDS区序列。该序列共编码390个氨基酸序列。生物信息学分析表明,DCS蛋白是一类定位于其他细胞器上的的非跨膜亲水性不稳定蛋白,DCS蛋白属于β-折叠型同源二聚体蛋白,具有Cond_enzymes基因家族典型的结构域,具有3个活性位点,11个产物结合位点,8个丙二酰辅酶A结合位点,31个查尔酮合酶二聚体界面。2、根据姜科植物C4H(肉桂酸-4-羟化酶)基因的序列信息设计简并引物扩增出姜黄C4H基因的保守区序列。经测序及NCBI上Blast比对分析,证明扩增得到了了姜黄C4H基因,采用RACE技术扩增得到该基因的5’端和3’端,从而得到C4H基因序列。结果表明该序列片段长度1842 bp,共编码446个氨基酸。生物信息学分析表明,推导的姜黄C4H分子量为51.72kD,整个多肽链亲水,推测蛋白质为不稳定,具有细胞色素P450结构域,与小果野蕉的亲缘关系相近。3、实时荧光定量PCR结果表明DCS基因在根、块茎、花瓣及叶片中均有表达,其中在块茎的表达量最高,花中的表达量最少,在低浓度的NaCl(25 g·L-1)胁迫下,DCS基因的表达量最高,而在高浓度的条件下DCS基因的表达量比较低,在SNP作用下,当浓度为0.05 mmol·L-1时,DCS基因的相对表达量最高;C4H基因在根中的表达量最高,其次为叶片,块茎和花中的表达量差别不大,不同浓度NaCl胁迫条件下,C4H基因的表达含量有增有减,在浓度NaCl(75 g·L-1)胁迫下C4H基因的表达量最高,在NaCl浓度为100 g·L-1时表达量最低;不同浓度的SNP都能够提高C4H基因的表达量,其中SNP浓度为0.1 mmol·L-1时,C4H基因的相对表达量最高。4、通过农杆菌介导法成功将CURS基因转入烟草组培苗,通过RT-PCR验证获得了转基因烟草植株。