研究背景高原习服的本质亟需更全面和深入的认识。维持能量平衡是细胞代谢在高原习服过程中主要的适应性改变,其中骨骼肌组织对能量代谢的调整,如代谢底物的选择,则是组织、细胞能量平衡维持的根本。储备量极其丰富的脂肪对于静息和收缩的肌肉组织是一种非常重要的氧化底物,但高原习服对骨骼肌脂肪酸氧化利用的影响目前仍有分歧。由于脂肪的“耗氧效应”,传统上认为在高原习服过程中骨骼肌对脂肪的依赖性减小,但并不能很好地解释高原习服过程中出现的一些间接反映脂肪氧化利用增强的现象,如血液中脂肪酸含量升高,肌肉中糖原储备增加等。我们先前的研究发现,高原习服过程中大鼠腓肠肌对葡萄糖的摄取率增加,同时葡萄糖转运体在细胞膜上功能活性的贮备以及在细胞内数量的储备增加,此时糖原含量较急性高原暴露时亦显著升高,提示高原习服引起的骨骼肌葡萄糖摄取率和葡萄糖转运体储备的增强主要用于糖原储备,此时腓肠肌能量的维持可能主要有赖于脂肪的氧化,由于没有测定脂肪和葡萄糖氧化利用情况,尚不能完全解释高原习服过程中骨骼肌组织脂肪氧化利用的本质。此外,研究表明耐力训练会引起机体对脂肪氧化的依赖性增强,以节省肌糖原和血葡萄糖,减少肌肉和血乳酸的堆积,所有这些代谢性适应反应在中等强度运动状态下耐力的提高中起重要的作用,但在高原习服过程中的作用目前尚不清楚。研究高原习服过程中骨骼肌组织对脂肪氧化利用的变化规律、机制及意义对阐明高原习服和/或适应的本质具有重要意义。目的本课题拟通过观察高原习服过程中(5,000 m,1天,15天和30天)大鼠腓肠肌脂肪氧化率和摄取率以及脂肪氧化代谢相关基因、蛋白表达等的变化,探讨高原习服过程中骨骼肌组织脂肪氧化利用的特点、机制及意义。方法雄性健康成年Sprague-Dawley大鼠随机分为平原对照组、高原暴露1天组、高原暴露15天组和高原暴露30天组。高原暴露组在模拟海拔5,000 m低压舱内饲养,每天23h。平原对照组在平原动物房内饲养。饲养到规定时间后,平原组在平原、高原暴露组在模拟海拔5,000 m低压舱内股动脉放血处死全部实验动物(10%氨基甲酸乙酯麻醉,1ml/100g体重,ip),收集血浆测定血浆非酯化脂肪酸(NEFA)含量,取大鼠两侧腓肠肌组织薄片用于葡萄糖氧化率、脂肪酸氧化率和摄取率的测定,取部分腓肠肌组织置液氮冻存。同位素法测定离体腓肠肌组织葡萄糖氧化率、脂肪酸氧化率和脂肪酸摄取率,比色法测定骨骼肌NEFA含量,HLPC法测定ATP、磷酸肌酸(PCr)含量,酶法测定葡萄糖、糖原和乳酸含量,RT-PCR法测定与脂肪氧化相关的基因如脂肪酸易位酶(fatty acid translocase,FAT/CD36)、肉毒碱软脂酰基转移酶I(carnitine palmitoyltransferase I,CPT-Ⅰ)、丙酮酸脱氢酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase isoenzyme 4 ,PDK4)、乙酰辅酶A羧化酶β(acetyl-CoA carboxylase 2,ACC-2)、过氧化物酶体增殖剂活化受体δ(peroxisome proliferator activated receptorδ,PPAR-δ)mRNA表达水平,免疫印迹法测定ACC-2和CPT-Ⅰ蛋白表达水平,同位素法测定CPT-Ⅰ活性。此外,PAS反应显示肌糖原,电镜观察肌肉组织中糖原颗粒的变化。另取雄性健康成年Sprague-Dawley大鼠随机分为:平原对照组、急性高原暴露组和慢性高原暴露组。平原对照组、急性高原暴露组和慢性高原暴露组与前述平原对照组、高原暴露1天组和高原暴露30天组的饲养条件相同。饲养到规定时间后每组又均分为两组,即静息组和力竭运动组。平原组在平原、高原暴露组在模拟海拔5,000 m低压舱内,静息组于安静状态、力竭运动组在跑台上行一次性力竭运动后(跑台速度20 m/min,坡度+10)即刻股动脉放血处死全部实验动物(10%氨基甲酸乙酯麻醉,1ml/100g体重,ip)。用前述方法分别测定相应的指标。结果与结论1、急性高原暴露(1天)骨骼肌PCr含量显著降低,随暴露时间延长逐渐回升,高原暴露30天恢复到平原水平;ATP含量在各组之间无显著性差异,表明高原习服过程中骨骼肌组织ATP水平可维持稳定。2、高原习服过程中骨骼肌组织脂肪氧化利用的变化(1)高原习服过程中血浆和骨骼肌组织NEFA含量显著升高;(2)高原暴露15天和30天骨骼肌组织脂肪酸氧化率和摄取率较平原和急性高原暴露时显著升高,而平原和急性高原暴露间无显著性差异。(3)急性高原暴露骨骼肌组织PPAR-δmRNA表达水平显著下调,高原暴露30天骨骼肌PPAR-δmRNA表达水平较急性高原暴露时显著上调,高原暴露30天与平原组无显著性差异。(4)高原暴露15天和30天骨骼肌组织CD36 mRNA表达水平较急性高原暴露时显著上调,而平原和急性高原暴露间无显著性差异。(5)高原暴露30天骨骼肌组织CPT-ⅠmRNA表达水平显著上调,CPT-Ⅰ蛋白表达水平较急性高原暴露时显著下调,随着暴露时间的延长逐渐上调。(6)高原暴露使骨骼肌组织CPT-Ⅰ活性显著下降,但随着暴露时间的延长活性逐渐恢复,高原暴露30天骨骼肌组织CPT-Ⅰ活性较急性高原暴露时显著升高。(7)高原暴露15天和30天骨骼肌组织ACC-2 mRNA表达水平显著下调,ACC-2蛋白表达水平较急性高原暴露时显著下调,随着暴露时间的延长逐渐上调。以上结果提示,高原习服过程中骨骼肌组织对脂肪氧化利用能力增强。3、高原习服过程中骨骼肌组织葡萄糖氧化利用的变化(1)高原习服过程中骨骼肌组织乳酸含量呈先升后降趋势。急性高原暴露时显著升高,随着暴露时间延长逐渐降低,高原暴露30天后接近平原水平。(2)急性高原暴露骨骼肌组织葡萄糖含量显著降低,随着暴露时间延长显著升高,甚至超过平原水平。(3)高原暴露后骨骼肌葡萄糖氧化率显著降低,高原暴露各组间无显著性差异。(4)高原暴露时骨骼肌糖原含量呈先降后升趋势。急性高原暴露骨骼肌组织糖原含量显著降低,随着暴露时间延长逐渐升高,高原暴露30天后接近平原水平。(5)高原暴露1天骨骼肌PAS反应明显减弱,细胞质内糖原颗粒明显减少;高原暴露15天和30天骨骼肌PAS反应比高原暴露1天明显增强,细胞质内糖原颗粒显著增多,染色较深,接近正常水平。(6)电镜显示:高原暴露5天骨骼肌组织细胞基质中糖原颗粒减少;高原暴露15天、30天骨骼肌组织细胞基质中糖原颗粒明显增多。(7)高原暴露30天组骨骼肌PDK4 mRNA表达较平原组和急性高原暴露组显著升高,而急性高原暴露组与平原组间无显著性差异。以上结果提示,高原习服过程中骨骼肌组织对葡萄糖的依赖性减低,利用减少,而骨骼肌糖原储备增加。4、高原暴露对运动能力的影响(1)急性高原暴露大鼠力竭运动时间较平原时显著降低,同时骨骼肌PCr、ATP、葡萄糖和糖原含量以及脂肪酸氧化率亦显著降低,而乳酸含量显著升高,提示急性高原暴露后大鼠运动能力下降,这与机体能量供应下降有关,此时机体有氧氧化能力显著降低,能量的维持主要依赖糖酵解提供能量。(2)慢性高原暴露大鼠力竭运动时间较急性高原暴露时显著延长,接近平原水平,同时骨骼肌中PCr、ATP和乳酸含量显著升高,葡萄糖氧化率较静息时亦显著升高,而糖原含量显著降低,提示慢性高原暴露后大鼠运动能力提高,慢性高原暴露后运动能力的提高与能量供应平衡恢复以及葡萄糖氧化供能增加有关。(3)慢性高原暴露力竭运动后,骨骼肌组织脂肪酸摄取率和CPT-Ⅰ活性升高,力竭运动时间和骨骼肌组织CPT-Ⅰ活性之间呈正相关关系,Y=28.056X+63.399 (r=0.897,p<0.05),提示慢性高原暴露后运动能力的提高与高原习服诱导的骨骼肌组织对脂肪酸氧化利用增强有关。(4)高原暴露力竭运动后,力竭运动组间骨骼肌组织PPARδmRNA、ACC-2 mRNA表达水平无显著性差异;CPT-ⅠmRNA表达水平、ACC-2蛋白表达水平和CPT-Ⅰ蛋白表达水平慢性高原暴露组较急性高原暴露组显著上调。总之,高原习服过程中:①骨骼肌组织ATP维持恒定与高原习服诱导的骨骼肌脂肪氧化利用增强有关;②骨骼肌对脂肪酸氧化利用增强与高原习服诱导的PPAR-δ基因表达水平上调、ACC-2蛋白表达下调以及CPT-Ⅰ活性升高有关;③骨骼肌对脂肪氧化利用增强,使大量的CHO以肌糖原的形式储存,做为应激状态(如力竭运动)时能源物资动员的储备;④慢性高原暴露后运动能力的提高与高原习服诱导的脂肪酸氧化利用的增强有关。