第一部分科罗索酸促进CaSki宫颈癌上皮细胞凋亡的作用研究目的宫颈癌是我国目前最常见的恶性肿瘤疾病之一。据不完全统计表明,宫颈癌已经成为了女性恶性肿瘤的第二位,且发病年龄年轻化、发病率和死亡率逐年提高,从而严重威胁我国女性的健康和生命安全。在目前宫颈癌的临床治疗中,通常以化疗药物为主,然而作为化疗药物主体的西药产生的毒副作用和耐药性问题,严重威胁着患者的临床预后和康复效果。因此,从毒副作用小和耐药性小的中药中,筛选抗宫颈癌的药物成为当前临床研究的热点和难点。科罗索酸(C30H48O4)作为一种天然的五环三萜化合物,来源于萼猕猴桃(猫人参)、枇杷、大叶紫薇等植物中。在多项临床和药理研究中指出,科罗索酸具有抗肿瘤、抗氧化、控制血糖和减肥的功效。在美国的减肥和糖尿病药物开发中,科罗索酸已经获得了 FDA的Ⅲ期临床试验阶段。也有多项研究指出,科罗索酸能通过抑制肿瘤细胞的活性、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤内的血管新生来起到很好的抗癌作用。同时科罗索酸是天然产物,而非人工合成,其生物相容性好,毒副作用和耐药性低等特点,更突出了其在抗肿瘤药物开发中的优势。因而,科罗索酸已经成为了抗肿瘤新药的热门候选药物之一。然而,科罗索酸抗肿瘤的研究多集中在肝癌、胃癌和肺癌中,然而对于其在宫颈癌上的研究还没有系统的报道。为了明确科罗索酸在宫颈癌治疗中的作用和临床价值,本文以不同浓度科罗索酸对人宫颈癌上皮细胞CaSki的凋亡活性的影响为研究目标,通过不同浓度科罗索酸与人宫颈癌上皮细胞CaSki混合培养,观察人宫颈癌上皮细胞CaSki的细胞形态、增殖能力、凋亡能力、凋亡率、细胞周期,小鼠皮下成瘤能力、以及其小鼠皮下成瘤组织中CaSki的增殖能力的变化规律,从而系统和全面的揭示科罗索酸促进人宫颈癌上皮细胞CaSki凋亡的作用规律,继而为宫颈癌的预防和治疗提供新的方法和策略。方法本研究以科罗索酸对人宫颈癌上皮细胞CaSki凋亡活性的影响为突破点,具体实验方法如下所述。1.应用不同浓度的科罗索酸(0、10、50、100μg/mL)与宫颈癌上皮细胞CaSki混合培养,观察宫颈癌上皮细胞CaSki的形态变化,从而分析不同浓度的科罗索酸对CaSki的细胞形态影响。2.应用MTT法和CCK-8法检测不同组别的人宫颈癌上皮细胞CaSki的增殖情况,从而分析不同浓度的科罗索酸(0、10、20、50、100μg/mL)对CaSki细胞增殖抑制率的影响。3.应用AO/PI染色和Hoechst 33258染色检测不同组别的人宫颈癌上皮细胞CaSki的细胞结构和形态的变化,尤其分析不同浓度的科罗索酸对CaSki细胞核的结构变化以及凋亡小体形成的影响;同时依据CaSki细胞核的结构变化确定凋亡和坏死细胞,从而计算不同组别CaSki细胞的凋亡和坏死率,继而确定不同浓度的科罗索酸(0、10、50、100μg/mL)对CaSki细胞凋亡的影响。4.应用流式细胞实验分析不同组别的人宫颈癌上皮细胞CaSki的细胞周期,从而分析不同浓度的科罗索酸(0、10、50、100μg/mL)对CaSki细胞周期的影响,继而分析CaSki细胞出现凋亡的原因。5.应用流式细胞实验分析不同组别的人宫颈癌上皮细胞CaSki的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率,继而探明不同浓度的科罗索酸(0、10、50、100μg/mL)对CaSki细胞凋亡的作用规律。6.应用人宫颈癌上皮细胞CaSki构建小鼠实体瘤模型,分别应用空白组、科罗索酸组(腹腔注射给药,药物浓度为10、50、100μg/mL),通过计算不同组别肿瘤的相对体积、重量和小鼠皮下成瘤抑制率,来研究不同浓度科罗索酸对CaSki在小鼠皮下成瘤能力的影响。7.应用免疫组化检测成瘤小鼠的肿瘤组织中CaSki的增殖情况,从而确定不同浓度科罗索酸对CaSki体内生长能力的影响。从而从动物和细胞水平验证科罗索酸诱导宫颈癌上皮细胞CaSki凋亡的作用。结果1.科罗索酸能显著抑制宫颈癌上皮细胞CaSki的增殖活性,同时显微镜下观察宫颈癌上皮细胞CaSki的细胞形态可知,随着对宫颈癌上皮细胞添加的科罗索酸浓度的提升宫颈癌上皮细胞CaSki的细胞凋亡状态的细胞逐渐增多,凋亡的CaSki细胞多呈现圆形,并从细胞团中脱落出来,并悬浮于培养液中,多以1个或几个脆片状存在,且体积较其他肿瘤细胞缩小,且细胞结构不清晰,出现凋亡趋势。2.科罗索酸能促进宫颈癌上皮细胞CaSki的凋亡,应用AO/PI染色和Hoechst 33258染色可见,科罗索酸能通过诱导CaSki的细胞核出现新月形、破碎状的凋亡小体,同时也出现细胞核不规则移位来促进CaSki的凋亡。3.10、50μg/mL科罗索酸能使得宫颈癌上皮细胞CaSki的更多停留在G0/G1期,从而降低宫颈癌上皮细胞CaSki的有丝分裂能力,继而降低其增殖能力;10、50、100μg/mL科罗索酸能使得宫颈癌上皮细胞CaSki在S期占比显著降低,从而缩短了 CaSki在S期内进行有丝分裂准备的时间,从而导致其进入G2/M期后遗传物质的缺失,促进其凋亡的形成;50、100μg/mL科罗索酸能使得宫颈癌上皮细胞CaSki在G2/M期,从而诱导CaSki的凋亡。4.科罗索酸能提升宫颈癌上皮细胞CaSki的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率。5.科罗索酸能通过降低宫颈癌上皮细胞CaSki在小鼠皮下成瘤中的肿瘤体积、重量,同时提升其在小鼠皮下成瘤的抑制率,来降低宫颈癌上皮细胞CaSki的在小鼠体内成瘤能力。6.科罗索酸能通过减少肿瘤组织中的有增殖能力的肿瘤细胞的数量和降低其肿瘤组织的肿瘤增殖指数,来抑制宫颈癌上皮细胞CaSki在肿瘤组织中的增殖活性。结论1.科罗索酸能通过抑制宫颈癌上皮细胞CaSki的增殖,提高CaSki的凋亡率,使CaSki细胞的细胞周期更多停滞在G0/G1期、G2/M期,缩短S期时间,诱导宫颈癌上皮细胞CaSki凋亡。2.科罗索酸对宫颈癌上皮细胞CaSki的增殖能力有抑制作用。第二部分科罗索酸对CaSki宫颈癌上皮细胞的PI3K/Akt信号通路的调控作用研究目的PI3K-Akt信号通路,是宫颈癌形成过程中最为重要的一类信号调节通路之一,主要参与宫颈癌细胞的增殖、凋亡、浸润、迁移和肿瘤内血管新生等诸多病理环节,在近代生命医学研究中更是将其作为宫颈癌标记物和治疗靶点进行研究。国内外专家对PI3K-Akt信号通路调控宫颈癌细胞的增殖、凋亡已经达成了共识,认为苏氨酸蛋白激酶AKT的激活必须在PI3K蛋白的催化下,形成AKT磷酸化蛋白(p-AKT),继而激活PI3K-AKT-mTOR下游信号蛋白,来促进宫颈癌细胞的增殖和抑制宫颈癌细胞的凋亡。由此可以推论,科罗索酸诱导宫颈癌上皮细胞CaSki凋亡的作用与PI3K-Akt信号通路密切相关。为了验证此推论,同时探索科罗索酸促进人宫颈癌上皮细胞CaSki凋亡的生物学机制,本研究拟通过不同浓度科罗索酸与人宫颈癌上皮细胞CaSki混合培养,应用western blot的方法检测人宫颈癌上皮细胞CaSki中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt表达量的变化,分析不同浓度科罗索酸对人宫颈癌上皮细胞中PI3K/Akt信号通路的影响,从而揭示科罗索酸通过作用PI3K/Akt信号通路来调控宫颈癌上皮细胞CaSki凋亡的机理,继而为进一步的开发宫颈癌治疗的天然药物提供理论依据和技术支持。方法1.配置不同浓度的科罗索酸(0、10、50、100μg/mL)与宫颈癌上皮细胞CaSki混合培养。2.应用Western Blot检测不同组别的人宫颈癌上皮细胞CaSki的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表达量,从而确定科罗索酸通过调控PI3K/AKT信号通路,来促进宫颈癌上皮细胞CaSki凋亡的过程。结果1.科罗索酸能抑制CaSki宫颈癌上皮细胞中PI3K总蛋白的表达;同时低浓度的科罗索酸能促进PI3K蛋白的磷酸化,从而诱导p-PI3K的高表达,而高浓度的科罗索酸却能抑制PI3K蛋白的磷酸化,从而降低p-PI3K的表达。2.科罗索酸能抑制CaSki宫颈癌上皮细胞中Akt总蛋白的表达;同时低浓度的科罗索酸能促进Akt蛋白的磷酸化,从而诱导p-Akt的高表达,而高浓度的科罗索酸却能抑制Akt蛋白的磷酸化,从而降低p-Akt的表达。结论科罗索酸对CaSki宫颈癌上皮细胞的抑制增殖和促凋亡的作用通过调节PI3K/Akt信号通路实现。