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目的视网膜缺血性损伤是指视网膜组织缺血缺氧后,恢复血液循环所致的损伤,常见于急性青光眼、视网膜中央动脉栓塞、视网膜中央静脉阻塞、青光眼、糖尿病视网膜病变等疾病。由于神经组织不能再生的特点,上述疾病经常导致视网膜形态和功能的明显改变,严重影响视功能,是目前眼科学者普遍关注的热点之一。近来一些研究表明某些神经生长因子能够促进神经节细胞的存活和轴突再生,如碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子、色素上皮衍生因子等。其中色素上皮衍生因子(pigment epithelium de-rived factor,PEDF)以其独有的双重作用,即神经保护和抗新生血管作用而受到日益关注。PEDF是在培养的人胎儿视网膜色素上皮细胞的基质中发现的一种分子量为50kD的蛋白质,主要由视网膜色素上皮细胞所合成和、分泌,是一种内源性保护因子,能够影响视网膜的分化发育和成熟,对视网膜的机械损伤、光损伤和缺血性损伤等具有促进修复的作用。但是PEDF蛋白在体内不稳定,半衰期短,需要多次大量用药。目前通过基因治疗的方法,可使外源基因转染到体内表达,在一段时间内持续提供高浓度的蛋白药物治疗,眼部具有解剖结构明确、介质透明、易于注射等特点适于做为基因治疗的靶器官。因此本实验在体外构建重组腺病毒介导的色素上皮衍生因子(Ad-PEDF),通过建立大鼠缺血再灌注模型,以玻璃体腔注射的方式将Ad-PEDF转染视网膜组织,观察PEDF蛋白表达及其对大鼠视网膜形态和功能的影响。方法1.利用细菌内重组的方法构建重组腺病毒载体Ad-PEDF,用酶切法将人PEDF的全长cDNA插入腺病毒穿梭质粒载体pSuCMV的多克隆位点。鉴定、筛选包含目的基因的正确克隆,将其与腺病毒骨架质粒载体一起用lipofectamine共转染至293细胞中,使其在293细胞内进行位点特异性重组及包装,用酶切法和PCR法鉴定后,在293细胞中大量扩增,氯化铯密度梯度离心纯化。2.选用健康成年Wistar大鼠96只,体重180-220克,随机分为正常组、缺血再灌注组、缺血再灌注+Ad-CMV组、缺血再灌注+Ad-PEDF组,每组24只。正常组不进行任何处理,缺血再灌注组、缺血再灌注+Ad-CMV组,缺血再灌注+Ad-PEDF组均首先制备视网膜缺血再灌注模型,缺血再灌注+Ad-PEDF组:玻璃体腔注射Ad-PEDF1μL(滴度3.8×10~9/PFU),缺血再灌注+Ad-CMV组:玻璃体腔注射Ad-CMV1μL,每组按照时间点12小时、24小时、72小时、168小时分为4亚组,每亚组分别为6只大鼠。3.动物模型制作:采用前房加压方法,大鼠麻醉后以4.5号输液针头自大鼠颞侧角膜缘穿刺入前房固定,接通预先连接好的乳酸钠林格氏液输液瓶,升高灌注瓶高度使大鼠眼压维持在110mmHg。观察球结膜、虹膜迅速苍白,间接检眼镜观察视网膜苍白水肿,证实引起视网膜缺血。灌注加压持续60分钟。4.以Western blotting方法检测各组不同时间点PEDF蛋白表达值。HE染色后应用图像分析软件系统测量距视盘边缘100μm长度内视网膜内层厚度(指视网膜内界膜到外丛状层内缘的距离)及神经节细胞层神经节细胞数量。以TUNEL方法计数各组大鼠视网膜组织切片凋亡细胞数量。以ERG分别测量双眼各时期ERG b波、Ops波波幅。结果1.将PEDF基因装入重组腺病毒载体表达系统,构建了PEDF重组腺病毒载体,经293细胞包装,获得了具有感染力的、非复制性的重组PEDF,经酶切和PCR鉴定,测序结果证实为包含有PEDF全长序列的腺病毒载体,经扩增纯化后浓度为3.8×10~9pfu/ml。2.腺病毒介导的PEDF玻璃体腔注射后视网膜PEDF蛋白表达增加,24小时PEDF表达明显增加,直至168小时仍持续在较高水平。Ad-PEDF玻璃体腔注射组各时间点PEDF蛋白表达明显多于缺血再灌注组及正常组,具有统计学差异。3.缺血再灌注后视网膜内层厚度减少,24小时达到最低值,在各时间点与正常组相比均有统计学差异,Ad-CMV组变化趋势与缺血组基本相同,Ad-PEDF治疗组12小时视网膜内层厚度增加,各时间段Ad-PEDF组视网膜内层厚度均超过缺血组及缺血+Ad-CMV组(P＜0.05),差异具有显著性。Ad-PEDF治疗组在各时间段RGCs数目多于缺血组及Ad-CMV组,差异具有显著性(P＜0.05)。Ad-PEDF治疗组可见视网膜神经节细胞凋亡细胞减少,凋亡程度减轻,与缺血组及Ad-CMV组相比差异具有显著性(P＜0.05)。4.缺血再灌注后ERG b波及Ops波幅明显降低,与正常组相比在各时间点有明显的统计学差异,缺血24小时ERGb波及Ops波幅降低最为明显,与缺血12小时、72小时、168小时相比差异具有显著性。Ad-PEDF能够明显促进ERGb波及Ops波幅恢复,与缺血组、缺血再灌注+Ad-CMV在各时间点均有明显统计学差异。结论1.复制缺陷型腺病毒载体介导的色素上皮衍生因子构建成功。Cre酶介导的loxP位点特异性重组是一种简单、高效的腺病毒载体构建方法。2.腺病毒介导的色素上皮衍生因子玻璃体腔注射后使大鼠视网膜组织色素上皮衍生因子蛋白表达增加。3.腺病毒介导的色素上皮衍生因子玻璃体腔注射能够恢复大鼠视网膜缺血再灌注损伤所致的视网膜内层厚度降低,神经节细胞密度减少。4.腺病毒介导的色素上皮衍生因子玻璃体腔注射能够减少大鼠视网膜缺血再灌注损伤所致神经节细胞凋亡。5.腺病毒介导的色素上皮衍生因子玻璃体腔注射能够促进大鼠视网膜缺血再灌注损伤所致b波、Ops波下降振幅恢复。6.色素上皮衍生因子基因治疗对大鼠视网膜缺血再灌注损伤具有神经保护作用。