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研究背景及目的:自2013年3月首次发现人类感染H7N9甲型禽流感病毒以来,在中国已经引起5波疫情流行阶段,病死率高达39.2%。病例主要集中在长三角和珠三角地区。与以往的禽流感不同的是,该病毒与人类受体能更有效地结合,因此增加了病毒在人群中爆发的可能,引起国内外广泛的关注。人感染H7N9后,一般表现流感样症状,白细胞和淋巴细胞减少。重症患者病情发展迅速,可表现为肺炎、急性呼吸窘迫综合征及急性肾损伤等。其病毒感染导致疾病的严重程度与机体的免疫状况直接相关。已有充分的证据表明,人感染H7N9禽流感病毒可导致“细胞因子风暴”,过度炎症反应可对器官造成不可弥补的损害,是高死亡率的原因之一。研究发现,在感染急性期,H7N9禽流感患者血清中的细胞因子和趋化因子水平与感染的严重程度密切相关。轻/重症患者的T细胞数量以及单核细胞数也存在差异。并且感染的严重程度与CD14+细胞的抗原提呈能力有关,重症患者相较于轻症患者CD14+细胞表面的人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)HLA-DR表达量显著较低。但是目前,对H7N9禽流感患者恢复期的免疫状况较少报道,这促使我们研究了H7N9轻/重症患者在恢复期的免疫状况。研究方法:我们对H7N9禽流感患者进行了感染后一年的免疫反应随访研究。首先将H7N9禽流感患者根据APACHE-Ⅱ评分分为轻度感染(n=42)和重度感染(n=26)。在收集、分析患者的临床资料后,分别在感染后的1、3和12个月采集患者的外周血样本。并在同一时间内,院内招募年龄、性别匹配的健康对照(n=40)。然后分别评估轻/重症感染患者的免疫恢复状况。通过对白细胞数量(White blood cell,WBC)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、淋巴细胞和单核细胞的检测,观察淋巴细胞减少等指标的恢复情况。通过流式细胞分析和酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA),比较轻/重症患者 H7N9 患者外周血中的淋巴细胞亚群分布和细胞因子水平。随后用流式细胞分析进一步比较轻/重症患者抗原提呈能力的差异。为了深入了解患者在恢复期对外来抗原的免疫反应,用热灭活的H7N9病毒或链球菌(Streptococcus)刺激外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。通过流式细胞仪检测 CD14+比例、HLA-DR 在CD14+细胞上的表达水平和CD4+和CD8+细胞的胞内IFN-y的产生,通过ELISA测定上清中IFN-γ和IL-6水平。最后,通过多因子免疫分析基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)水平差异,分析轻/重症患者组织修复倾向。研究结果:我们发现两组患者在感染后1个月,WBC和CRP都已恢复正常,淋巴细胞总数和单核细胞的百分比也都在感染1个月后恢复正常。我们进一步分析淋巴细胞亚群和细胞因子水平后发现,虽然在感染初期重症患者CD3+T细胞和CD8+T细胞的比例显著低于轻症患者,在感染后1个月,二组之间已无差异;CD4+T细胞、B细胞和NK细胞无论在感染初期还是恢复期都无差异;在重度感染的人群中,IFN-γ、IFN-α在感染初期显著较低,1个月后恢复正常,而且轻/重症患者之间无差异;TNF-α无论在感染初期还是恢复期间都没有差异。为了进一步比较两组的免疫状态差异,对患者的单核细胞功能的恢复进行了比较。尽管在感染初期,轻症患者CD14+细胞的比例显著高于重症患者;在感染后1个月,重症患者的CD14+细胞的比例显著高于感染初期的比例,并且与轻症患者无差异。但分析HLA-DR在CD14+细胞上的表达发现,在感染后1个月,轻症患者CD14+细胞上HLA-DR的表达已经接近健康对照,而此时重症患者仍显著较低,说明在感染后1个月,重度感染的人群中,他们的抗原提呈能力仍然受损,而轻症患者已经恢复至接近正常水平。重症患者免疫反应持续受损还表现在外来抗原刺激后抗原提呈能力低于轻症患者。用灭活的链球菌(Streptococcus)刺激PBMCs后发现,在感染后1个月,重症患者的CD14+细胞上HLA-DR的表达、IFN-γ、IL-6在培养上清中的水平显著低于轻症患者。重症患者的CD4+T和CD8+T细胞产生的IFN-γ显著低于轻症患者。感染后3个月,两组之间无差异。最后检测了患者的多种MMP水平,发现在感染初期,H7N9患者的大部分MMP水平显著高于健康对照。在感染后1个月,轻症患者血浆中的MMP水平降低,接近健康对照,而重症患者MMP2、MMP3和MMP9的水平仍然显著高于健康对照和轻度感染患者。感染后3个月,MMP水平都已恢复至正常。研究结论:以上研究发现,在感染后1个月,无论轻/重症患者,淋巴细胞减少的症状得到恢复,并且外周血淋巴细胞亚群的分布以及细胞因子的水平恢复正常。然而,在感染后1个月,单核细胞中HLA-DR的表达量在重症患者中更低,至3个月恢复正常。说明重症患者的抗原提呈能力在1个月时还未得到恢复,而此时轻症患者的抗原提呈能力已接近正常水平。在应对外来抗原的刺激时,得到了相似的结论,即重症患者在感染后1个月,相较于轻症患者,其免疫反应能力仍然较弱。综上所述,在患者感染H7N9后,重症患者相较于轻症患者其免疫恢复延迟,表现为单核细胞的抗原提呈能力受损,进而T细胞反应受损。这可能会增加继发性细菌感染的可能性。