觉醒（wakefulness）是感觉、运动、认知和意识的基础。觉醒不良与嗜睡、木僵和昏迷状态密切相关。觉醒由一系列分布于脑干、下丘脑和皮层下脑区的神经元核团调控,如蓝斑（locus coeruleus,LC）去甲肾上腺素能神经元、外侧下丘脑（lateral hypothalamus,LH）觉醒肽（hypocretin,Hcrt）神经元和基底前脑（basal forebrain,BF）胆碱能神经元等。丘脑是觉醒系统背侧通路的主要组成部分,控制和处理觉醒信息传递至大脑皮层。因此,丘脑对维持皮层激活和行为觉醒是必不可少的。旁正中丘脑（paramedian thalamus）局灶性损伤患者表现出意识障碍等临床症状。双侧旁正中丘脑损患者甚至出现严重嗜睡和昏迷,提示旁正中丘脑是觉醒调控的重要位点。旁正中丘脑由具有不同输入-输出联系的神经元核团组成,这些核团参与执行不同的脑功能。但是,参与觉醒调控的神经元核团及其相关神经环路尚未得到鉴定。丘脑室旁核（paraventricular thalamus,PVT）位于中线丘脑的背侧部,是非特异性投射丘脑的一部分。PVT接受来自脑干和下丘脑觉醒系统神经元的输入,如大量的Hcrt神经元输入。同时,PVT投射至伏隔核（nucleus accumbens,NAc）、杏仁核和广泛的皮层区域并参与调控觉醒状态依赖的行为,如成瘾与奖赏、摄食、应激和情绪等。PVT神经元活动具有明显的觉醒相关的昼夜节律性。啮齿类动物即刻早期基因及其蛋白产物c-fos活跃期（黑暗期）水平明显高于静息期（光照期）。此外,PVT神经元动作电位发放和内在电生理特性同样表现出昼夜节律性变化。因此,PVT可能是丘脑和LH觉醒环路整合中心,在觉醒调控中起着至关重要的作用。但是,PVT参与觉醒调控的直接证据仍然十分缺乏。因此,本课题首先采用光纤钙信号记录、在体多通道和脑电-肌电（electroencephalogram-electromyogram,EEG-EMG）记录技术观察PVT神经元在自然睡眠-觉醒周期中的活动模式。接着采用化学遗传学和光遗传学方法研究PVT在觉醒调控中的作用。最后应用神经环路示踪和操控手段探究PVT调控觉醒的神经环路机制。主要结果如下:1.PVT神经元活动与觉醒状态密切相关鉴于PVT独特的输入-输出联系和活动模式,我们推测PVT是调控觉醒的关键旁正中丘脑核团。我们首先构建了小鼠旁正中丘脑在经过一段时间睡眠（授时时间（zeitgeber time,ZT）6;12:00）、觉醒（ZT 18;24:00）和延长觉醒（ZT 0-ZT 6）后的c-fos无偏差表达图谱。我们发现,PVT神经元c-fos表达在ZT 18和延长觉醒期间明显高于ZT 6（one way ANOVA,P<0.001,n=5）,提示PVT神经元活性在觉醒期更高。接下来我们使用光纤钙信号记录研究PVT神经元在自然睡眠-觉醒周期中的活动模式。我们向PVT注射以CaMKIIα为启动子的编码钙活动指示剂GCaMP6f的腺相关病毒（adeno-associated virus）（AAV-CaMKIIα-GCaMP6f）,并且于4周后记录神经元集群钙信号。PVT谷氨酸能神经元钙信号在睡眠-觉醒周期中波动性变化。觉醒期钙信号强度（ΔF/F）和瞬时频率均明显高于非快眼动（non-rapid eye movement,NREM）睡眠和快眼动（rapid eye movement,REM）睡眠期(one way RM ANOVA,ΔF/F:P _{Wake vs NREM}<0.001,P _{Wake vs REM}=0.042;瞬时频率:P _{Wake vs NREM}<0.001,P _{Wake vs REM}=0.002;n=7)。此外,PVT神经元钙信号在进入睡眠时逐渐降低,但是睡眠转换为觉醒时显著增强（paired t test,P Wake→NREM<0.001,P NREM→Wake=0.001,P REM→Wake=0.014,n=7）。为直接观察PVT神经元的放电活动,我们开展了在体多通道电生理记录实验。通过在PVT埋置多通道电极,我们成功采集22个PVT神经元的放电活动。大部分（20/22）PVT神经元觉醒期放电显著高于睡眠期(one-way RM ANOVA,P _{Wake vs NREM}<0.001,P _{Wake vs REM}<0.001,n=20)。我们进一步分析PVT放电活动在睡眠-觉醒状态转换过程中的动力学特征。PVT神经元放电频率在进入NREM睡眠之前逐渐降低(wilcoxon signed rank test,P _Wake→NREM<0.001,n=20)。但是,在由睡眠向觉醒转换的过程中,PVT神经元放电频率急剧上升(paired t test,P _NREM→_Wake<0.001,P _REM→_Wake=0.002,n=20)。从NREM睡眠转换为行为觉醒时,PVT平均放电频率达到7.1 Hz。其中,相当一部分（25%）PVT神经元放电频率甚至超过10 Hz。PVT放电频率开始升高出现在皮层激活（1.0±0.3 s）和行为觉醒之前（1.4±0.3 s）。2.化学遗传学抑制或DTA特异性毁损PVT神经元降低觉醒在单细胞和神经元集群水平监测PVT活动之后,我们首先采用化学遗传学方法抑制PVT谷氨酸能神经元,以确定PVT活动对觉醒调控的必要性。我们向PVT注射编码抑制性hM4D受体的AAV-CaMKIIα-hM4D-mCherry。全细胞膜片钳实验表明hM4D的配体氯氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide,CNO）诱导hM4D-表达PVT神经元膜电位超极化和放电频率降低。我们接下来研究化学遗传学抑制PVT谷氨酸能神经元对睡眠-觉醒状态的影响。在小鼠黑暗期开始时（ZT 12）,腹腔内注射CNO抑制PVT显著降低觉醒时间（two-way RM ANOVA,Wake:P<0.001;NREM:P<0.001;REM:P h M4D（Saline vsCNO）<0.001,P CNO（m Cherry vs h M4D）=0.008;nm Cherry=8,nh M4D=13）。CNO注射同时还导致觉醒片段化,包括觉醒片段时程缩短和觉醒片段数量增多（two-way RM ANOVA,length of the longest episode:P<0.001;episode duration:P h M4D（Saline vs CNO）<0.001;number of episode:P h M4D（Saline vs CNO）<0.001,P CNO（m Cherry vs h M4D）=0.005,nm Cherry=8,nh M4D=13）。这可能是微觉醒数量增加所致（paired t test,P ZT 13=0.002,P ZT 14<0.001,n=13）。并且,CNO注射缩短进入睡眠的潜伏期（two-way RM ANOVA,NREM:P h M4D（Saline vs CNO）<0.001,P CNO（m Cherry vs h M4D）=0.004;REM:P h M4D（Saline vs CNO）=0.009;nm Cherry=8,nh M4D=13）并增加睡眠片段数量（two-way RM ANOVA,P<0.001,nm Cherry=8,nh M4D=13）,但是对睡眠片段时程无明显影响。此外,EEG能谱分析表明CNO注射后2小时觉醒期高频delta（2-4 Hz）能量增加（paired t test,P=0.048,n=10）。但是,小鼠光照期开始时（ZT0）注射CNO对睡眠-觉醒无明显影响。除使用化学遗传学方法可逆性抑制PVT活动外,我们还采用毁损方式研究PVT在觉醒调控中的作用。我们向PVT注射AAV-Ca MKIIa-Cre-GFP和编码白喉毒素A（diphtheria toxin A,DTA）的AAV-EF1α-DIO-DTA混合液,使用DTA毁损PVT谷氨酸能神经元。病毒注射4周后,DTA毁损小鼠出现持续的觉醒损害,表现为黑暗期觉醒水平下降,但是对光照期睡眠-觉醒状态无明显影响（unpaired t test,Wake:P dark=0.014,P 24h=0.03;NREM:P dark=0.006,P 24h=0.024;n Control=7,n DTA lesion=9）。此外,DTA毁损导致觉醒片段化（mann-whitney rank sum test,number of episode:P=0.02;episode duration:P=0.011;micro-arousal:P=0.015;n Control=7,n DTA lesion=9）和NREM睡眠片段数量增加（unpaired t test,P=0.002,n Control=7,n DTA lesion=9）。DTA毁损还明显改变EEG能谱,表现为增加高频delta（2-4 Hz）和低频theta（4-7 Hz）能量,但降低alpha（10-20 Hz）能量（unpaired t test,P high delta=0.021,P low theta=0.004,P alpha<0.001,n=6）。综上所述,这部分结果提示PVT对觉醒维持是必不可少的。3.光遗传学激活PVT神经元诱发睡眠和麻醉状态向觉醒的转换我们接下来采用光遗传学方法研究PVT在觉醒调控中的作用。我们向PVT注射表达光敏感通道蛋白2（channelrhodopsin 2,Ch R2）的AAV-Ca MKIIα-Ch R2-m Cherry。1²0 Hz的473nm光脉冲可靠地诱发高保真度的动作电位发放。在小鼠进入稳定的睡眠后,我们给予持续20 s的光刺激,检测光遗传学激活PVT是否能够诱发睡眠向觉醒的转换。我们发现,光激活PVT谷氨酸能神经元诱发刺激频率依赖性的NREM睡眠向觉醒转换（unpaired t test,P 1 Hz=0.005,P 5 Hz<0.001,P 7 Hz<0.001,P 10 Hz<0.001,P20 Hz<0.001,n7 Hz=5,其余组n=10）。光刺激同样诱发REM睡眠向觉醒转换（unpairedt test,P 5 Hz<0.002,P 10 Hz<0.001,P 20 Hz<0.001,n=10）。此外,与m Cherry对照组小鼠相比光刺激显著增加Ch R2小鼠觉醒期的概率,然而降低睡眠期概率（unpaired t test,NREM:P<0.001;REM:P<0.001;n=10）。我们进一步施加10 s/min持续1h的10 Hz光刺激,探究PVT神经元维持觉醒的能力。长时间光刺激导致觉醒明显增加（unpaired t test,P<0.001,n=10）,显著延长觉醒片段时程并缩短NREM睡眠时程（unpaired t test,P<0.001,n=10）。此外,光刺激还导致EEG delta（0.5-4 Hz）能量明显下降（unpaired t test,P<0.001,n=10）。旁正中丘脑梗阻病人的一个典型临床表现是意识的丧失。为研究激活PVT是否能够在无意识状态中诱发觉醒,我们使用异氟烷诱导小鼠进入麻醉状态,同时采用光遗传学激活PVT神经元。当小鼠EEG进入稳定的爆发式放电抑制（burst-suppression）模式后,我们给予持续20s的10 Hz光刺激。光激活快速的诱发EEG burst活动增加,表现为其时程的延长（Ch R2:wilcoxon signed rank test,P=0.016,n=7;10 Hz:unpaired t test,P<0.001,n m Cherry=5,n Ch R2=7）和burst-suppression比率下降（Ch R2:paired t test,P<0.001,n=7;10 Hz:mann-whitney rank sum test,P=0.003,n m Cherry=5,n Ch R2=7）。更为重要的是,持续激活PVT神经元显著加速小鼠自异氟烷诱导的无意识状态中苏醒所需的时间（Ch R2:paired t test,P=0.003,n=7;10 Hz:unpaired t test,P=0.0156,n m Cherry=5,n Ch R2=7）。4.PVT→NAc通路介导PVT的觉醒调控作用我们接下来探究介导PVT调控觉醒的下游神经通路。Ch R2-m Cherry标记的神经末梢分布模式表明PVT谷氨酸能神经元投射至多个皮层脑区,包括内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex,m PFC）和岛叶皮层。双侧光激活PVT投射至m PFC缘前区的神经末梢不能诱导出快速的睡眠向觉醒的转换。光激活PVT投射至岛叶皮层的神经末梢同样对睡眠-觉醒转换无明显影响。这些结果不足以支持PVT→皮层通路在觉醒调控中具有重要作用。值得注意的是,NAc包含致密的Ch R2-m Cherry标记的神经末梢。因此,我们探究PVT→NAc通路在觉醒调控中的作用。10 Hz光激活PVT→NAc通路稳定的诱发出快速的NREM和REM睡眠向觉醒的转换（unpaired t test,NREM:P 1 Hz=0.945,P 10 Hz=0.003;REM:P 1 Hz=0.217,P 10 Hz<0.001,n=5）。离体Ch R2辅助的环路示踪方法被应用于研究PVT和NAc之间的功能联系。我们采用全细胞膜片钳技术观察离体脑片NAc神经元对光遗传学激活PVT末梢的反应。10 Hz光激活PVT末梢在记录神经元诱发兴奋性突触后电流（excitory postsynaptic currents,EPSCs）。EPSCs的短潜伏期提示PVT和NAc形成单突触联系。鹅膏酸毁损NAc神经元显著延长光遗传学激活PVT谷氨酸能诱导的NREM睡眠向觉醒转换的潜伏期（mann-whitney rank sum test,P 10 Hz=0.002,P 20Hz=0.002,n Control=5,n NAc lesion=8）,进一步证实PVT→NAc通路的意义。为了进一步研究PVT→NAc通路在觉醒调控中的重要性,我们采用环路特异性化学遗传学方法抑制NAc-投射PVT神经元。我们在NAc注射编码Cre重组酶的逆行传递AAVretro-Syn-Cre,同时在PVT注射Cre依赖的AAV-EF1α-DIO-h M4D-m Cherry。这种策略有效的标记NAc-投射PVT神经元。黑暗期开始时腹腔注射CNO显著降低注射后3h内的觉醒量（two-way RM ANOVA,Wake:P h M4D（Saline vs CNO）=0.004,P CNO（m Cherry vs h M4D）=0.014;NREM:P h M4D（Saline vs CNO）=0.003;P CNO（m Cherry vs h M4D）=0.005;n=7）。综上,这部分结果提示PVT→NAc通路介导PVT的觉醒调控作用。5.PVT的觉醒调控功能受到LH Hcrt神经元的调节PVT区别与其他中线丘脑核团的一个显著特征是其接受大量的肽能神经输入。课题组其他成员使用基于狂犬病毒逆行单突触示踪技术,证明PVT接受Hcrt神经元的单突触输入。我们使用光遗传学方法研究LHHcrt→PVT通路在觉醒调控中的功能性作用。Hcrt-Cre小鼠双侧LH接受AAV-EF1α-DIO-Ch R2-m Cherry注射。我们在PVT埋置光电极,在记录PVT神经元放电和EEG-EMG同时光遗传学激活Hcrt神经元末梢。20 Hz光刺激显著增加PVT神经元放电频率（wilcoxon signed rank test,P<0.001,n=17）。在行为学水平,光刺激诱发快速的NREM和REM睡眠向觉醒的转换（unpaired t test,NREM:P 1 Hz=0.62,P 20 Hz<0.001;REM:P 1 Hz=0.724,P 20 Hz<0.001,n=7）。光刺激同时增加觉醒的概率（unpaired t test,NREM:P<0.001,n=7）。为了进一步研究LHHcrt→PVT通路在觉醒调控中的重要性,我们在光刺激开始前向PVT微注射2型Hcrt受体阻断剂TCS-OX2-29。TCS-OX2-29减弱了光刺激诱导的促觉醒效应（paired t test,P NREM=0.005,P REM=0.044,n=6）。我们向双侧LH微注射毒蝇蕈醇（muscimol）阻断末梢激活所致可能回传的动作电位。在此情况下,光激活仍然诱发睡眠向觉醒的转换。综上所述,本研究发现,PVT活动在单细胞和神经元集群水平均与觉醒密切相关。化学遗传学抑制和特异性毁损PVT谷氨酸能神经元降低觉醒,但是光遗传学激活PVT谷氨酸能神经元不仅促进睡眠向觉醒的转换,而且加速自麻醉状态中的苏醒。此外,我们进一步发现PVT的觉醒调控功能由PVT→NAc通路介导并接受Hcrt神经元的调节。总之,本研究证明PVT是重要的丘脑觉醒调控核团。