胰腺癌是恶性度最高的肿瘤之一,确诊和治疗较为困难,死亡率高,预后差,其发病率与死亡率相接近。现在越来越多的细胞学和分子生物学证据证实,肿瘤发生起源于肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells,CSCs）。CSCs由于其自我更新能力和耐药特性,参与肿瘤的转移和复发。脂质运载蛋白-2（Lipocalin-2,Lcn2）是25KD的分泌型糖蛋白,属于载脂蛋白超家族成员,也是新近发现的一种与肿瘤高度相关的蛋白。目前有研究表明Lcn2表达程度的不同与胰腺癌的发生发展密切相关。Lcn2具有多种重要的生物功能,参与许多生命过程,包括凋亡、增殖、信号转导、肿瘤细胞的发生以及肿瘤的发展进程。然而,Lcn2在调控胰腺癌细胞干细胞特性中的作用及其机制尚不清楚。本课题组前期应用高通量测序技术,系统分析全基因组后发现Lcn2在胰腺癌干细胞中的表达明显下调,通过多种分子生物学实验和动物体内实验,观察到Lcn2与干细胞标志物表达呈负相关,且通过负向调控c-Jun磷酸化影响胰腺癌细胞的“干性”。由此,本课题拟通过对Lcn2/c-Jun调控轴的研究,探讨Lcn2在调控胰腺癌细胞干性转归过程中的作用及具体分子机制,推动胰腺癌转移和复发相关的病理研究,将为筛选新的胰腺癌靶点提供理论基础和科学依据。目的:本研究通过探究Lcn2对胰腺癌细胞干性的影响,明确其分子作用机制,为进一步认识胰腺癌转移和复发过程及筛选新靶点提供实验依据。方法:1.免疫组化的方法检测Lcn2在人胰腺癌组织中的表达程度,并分析其与胰腺癌临床病理特征的相关性。2.在PANC-1和MIA-Pa Ca2胰腺癌细胞中,通过质粒转染的方法构建稳定过表达Lcn2的胰腺癌细胞系并检测干细胞标志物SOX2、OCT4、CD24、Nanog、CD44和Ep CAM的表达。3.在Bx PC3胰腺癌细胞中,通过感染Lenti-Cas9-puro-Lcn2敲除慢病毒,构建稳定敲除Lcn2细胞系并检测干细胞标志物SOX2、OCT4、CD24、Nanog、CD44和Ep CAM的表达。4.成球实验检测Lcn2过表达和敲除细胞系各组间的成球数目。5.通过皮下注射的方式构建荷瘤模型,体内水平验证Lcn2过表达和敲低后对胰腺癌细胞干性特征的影响。6.利用磷酸蛋白芯片初筛Lcn2调控的下游分子,并通过western blot方法验证差异分子的表达。7.通过质粒转染、抑制剂和激动剂处理细胞,检测差异分子上下游调控关系。8.检测Lcn2下游分子p-c-Jun对胰腺癌细胞干性标志物的表达及成球能力的影响。9.检测肿瘤微环境中转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）,对Lcn2表达的调控关系。结果:1.分别对GEO（Gene Expression Omnibus）和TCGA（Cancer Genome Atlas）数据库数据分析后发现,对比正常胰腺组织,Lcn2在胰腺癌组织中表达升高。通过利用组织芯片进行Lcn2免疫组化染色后评分,统计结果和数据库结果一致,显示Lcn2在胰腺癌组织中显著高表达;且其表达量与病人年龄、性别、临床分期和病理分级无相关性。2.在三株胰腺癌细胞株（PANC-1,MIA-Pa Ca2,Bx PC3）中,检测Lcn2蛋白的内源性表达,结果显示在PANC-1和MIA-Pa Ca2细胞株中Lcn2弱表达,Bx PC3中Lcn2高表达;3.构建pc DNA3.1-Myc/His A和pc DNA3.1-Myc/His A-Lcn2过表达质粒,对PANC-1瞬时转染并检测质粒的质量和Lcn2抗体的特异性。质粒质量和抗体检测良好,构建PANC-1和MIA-Pa Ca2稳定过表达Lcn2细胞系。用CRISPR-Ca S9 Lcn2敲除慢病毒构建Bx PC3稳定敲除Lcn2细胞系。Western blot结果显示Lcn2稳定过表达和敲除细胞系构建成功;4.利用PANC-1过表达Lcn2细胞系和Bx PC3敲除Lcn2细胞系,在m RNA水平检测干性marker,结果显示,与对照组相比,过表达Lcn2后,SOX2,OCT4,CD24,Nanog干性marker降低,敲除Lcn2后SOX2,OCT4,CD24,Nanog增强;5.检测PANC-1稳定过表达Lcn2细胞和Bx PC3敲除Lcn2后干性marker的蛋白表达水平,结果显示过表达Lcn2后,SOX2,Ep CAM,CD44显著降低,CD133无明显差异。敲除Lcn2后,SOX2,Ep CAM,OCT4,Nanog,c-Myc,CD44显著升高;6.分别利用Lcn2稳定过表达和敲除细胞系检测实验组和对照组的成球能力,结果显示与对照组相比,过表达Lcn2组成球数目减少,敲除Lcn2组成球数目增多;7.在裸鼠皮下荷瘤实验中发现,与对照组相比,过表达Lcn2组肿瘤体积和重量减少,敲除Lcn2组肿瘤体积和重量增加;8.利用磷酸化蛋白质位点抗体芯片筛选敲除Lcn2后引起的差异蛋白,经检测后发现,敲除Lcn2组,AKT、JNK和c-Jun的磷酸化水平明显上调;9.通过转染AKT质粒和抑制剂以及使用JNK通路激动剂和抑制剂处理后,发现AKT和JNK是c-Jun的上游调控分子;10.Western blot和成球实验表明c-Jun正向调控胰腺癌干细胞marker表达以及促进胰腺癌细胞的成球能力;11.检测肿瘤微环境中TGF-β1,对Lcn2表达的调控关系,发现TGF-β1可以通过抑制Lcn2的表达上调磷酸化的c-Jun;结论:1.Lcn2在胰腺癌组织中表达显著高于正常胰腺组织,且其表达量与病人年龄、性别、临床分期和肿瘤分化程度无相关性。2.Lcn2对胰腺癌细胞“干性”具有负向调控作用。3.Lcn2通过AKT/JNK/c-Jun信号通路调控胰腺癌细胞“干性”。4.TGF-β1可通过抑制Lcn2促进p-c-Jun的表达介导胰腺癌细胞“干性”的转归。