热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)的佐剂样效应以及在抗肿瘤及抗感染免疫中的应用，一直是HSP研究领域的热点，HSP70作为热休克蛋白家族的重要成员，有大量的报道和研究证实，从肿瘤组织中分离的HSP70在动物体内能诱导出明显的肿瘤特异性CTL，对随后接种肿瘤细胞具有抵抗作用。采用HSP70-抗原肽复合物作为疫苗诱导抗肿瘤抗感染免疫已经进入临床试验阶段并显示了良好的应用前景。但作为个性化的治疗模式，该方案难以产业化，因此体外表达HSP70分子，然后与抗原肽交联，可能成为一种新型疫苗和新的治疗模式，在本研究中，我们采用原核表达系统，对人HSP70D分子进行大规模的表达纯化，旨在建立一种新的HSP70纯化的方式，研究所纯化的人HSP70D的佐剂样效应，并将其应用于肿瘤的免疫治疗。 首先，根据人HSP70D cDNA序列设计一对包含HSP70D全长编码区的PCR引物。其中上游引物为5’TA CAT ATG GCC AAA GCC GCG GCA GTC G(包含起始码ATG，5’端包含Nde Ⅰ酶切位点)，下游引物为5’TG CTC GAG ATC TAC CTC CTC AAT GGT GGG(不包含终止码TGA，5’端含Xho Ⅰ位点)。预期通过Nde Ⅰ／Xho Ⅰ双酶切连接到原核表达载体pET-24a(+)。随后，我们采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从人宫颈上皮癌细胞系HeLa细胞中克隆了人HSP70D全长编码区cDNA序列。采用Trizol试剂提取人宫颈上皮癌细胞系HeLa细胞总RNA，并利用AMV反转录酶活性将5 μg HeLa细胞总RNA反转录为cDNA。以人β-actin引物进行阳性对照扩增，得到400bp的预期片段后，采用HSP70D上、下游引物进行扩增，扩增参数为95°C 15秒，59°C 30秒，72°C 1分钟，25循环后72°C延伸10分钟。经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析显示，通过RT-PCR从经HeLa细胞cDNA中克隆到了相当于预期大小1933 bp的单一特异性条带。PCR产物经纯化后进行Nde第乡军医大学硕士学位论比1一食为当n互I胭汤oI酶切，酶切产物经胶回收后与八甘日F火关01酶切的pET-24a(+)载体连接，转化大肠杆菌DH5a。挑取克隆进行纯化并经从距1儿确口I酶切鉴定。电泳结果显示，阳性插入克隆可以得到一条约1925bP的插入片段条带以及一条约5300 bp的载体条带。最后阳性插入克隆以通用引物T7 promotor引物和T7 terminato:引物，以及4条HSP7OD的基因特异性引物进行DNA序列测定，序列正确的阳性质粒重新转化至感受态细菌BLZI[F一，ompT，hsds(旧一，mB一)，gal]。经从距I人勘01酶切鉴定阳性克隆后，重组子一记为pET24a一HSP70D，用于随后进行的HSP70D蛋白表达和纯化以及功能研究。 为了获得足够数量及符合临床试验要求的重组人HSP7O，我们在前一部分实验完成了基因工程人HSP7OD的高表达菌种的构建及筛选的基础上，对其发酵表达条件及纯化条件进行优化，确定最佳的条件和方法，建立稳定、可靠的生产工艺。 首先通过摇床发酵实验我们观察了不同的培养基包括LB、ZYT、SOB、SOC、MgCA培养基对工程菌生长及重组HSP70D蛋白表达量的影响。结果表明，工程菌在LB、ZYT培养基中细菌生长较快，但当生长至一定密度后细菌的生长出现停滞。而在MgCA培养基中细菌生长速度稍慢，但由于培养基具有很好的缓冲能力，因此可获较高的生长密度。在低密度生长时，加入IPTG诱导后工程菌在各培养基中的rllHSP7OD表达量无显著差异。在发酵罐发酵实验中，我们对工程菌的在发酵罐中的生长曲线进行了研究，并选择了最适的细菌生长密度。结果表明，经过16小时培养后，细菌的OD600值可达12以上，此时加入mTG诱导后，目的蛋白rhHSP70D诱导表达水平最高，可达细菌总蛋白的20%以上，较摇床发酵实验表达量有明显的提高。 本工程菌采用的载体pET24a以T7作为启动子，它受Lacl表达的阻蛋白的抑制。由于Lacl的存在限制了外源基因的持续、高水平的表达，对宿主菌起到稳定作用。但诱导剂正TG可以消除Lacl表达阻遏蛋白对外源基因表达抑制。不同浓度IPTG加入后，对目的蛋白的表达会产生一定的影响。一般地，采用0.1一smM IPTG可诱导多种目的蛋白的表达，在一定范围内，IPTG的浓度与表达产物的产量成正比，但过高的正TG浓度，由于蛋白质表达量增加，影响蛋白质的正确折叠，从而使一部分原来以可溶性表达的目的蛋白转变为包涵体形式存在，从而对后续的纯化和制备过程产生影响。互组生医人学硕十学位论 通过小量发酵实验，我们探讨了不同矽TG浓度对rhHSP7O表达量的影响，并观察了不同诱导时间后thHSP7OD的表达量。结果表明IPTG浓度在0.1一lmM范围内，:hHsP70D的表达量随着加入诱导剂浓度的增加而增加，且可溶性rhHsP7o的比例无明显变化。加入IPTG诱导后30min，即可见明显的:hHSP7OD表达，在0.5一4小时内thHSP70D表达量随诱导时间的延长而增加。 由于重组表达的rhHSP70D以可溶性蛋白形式存在于细菌胞浆内，因此在纯化初期我们对细菌破菌后上清进行了预处理，通过乙醇沉淀条件的优化，选择含IOmM氯化钙、10mM氯化镁及20%乙醇对上清进行沉淀，使样品的粘度下降，纯度提高。随后我们对样品进行DEAE一sepharoseFF阴离子交换柱层析，通过溶液的pH值、离子强度、洗脱方