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糖尿病肾病(diabetickidney disease,DKD)是糖尿病(diabetic mellitus,DM)的特征性微血管并发症。2017年全世界DM患病人数已达4.51亿,预计到2045年将达到6.93亿。大约30%的T1DM和40%的T2DM患者会发展为DKD。DKD已经成为终末期肾病及DM患者致死率增加的重要原因。蛋白尿是DKD的主要临床诊断与疗效评价指标。导师认为,蛋白属于人体至精至微之物,化生于饮食水谷,由脾脏升清转输于人体各处。脾气大亏,清气不升,精微下注为浊是DKD蛋白尿产生的关键,常由脾及肾,损及肾阴。DKD属于中医络脉病变,血瘀贯穿始终。据此,导师以“升清降浊”为核心理论,以补气升清为基本治则,辅以养阴、活血、通络之法,拟定芪参升清降浊方(简称芪参方,Qi-Shen-Fang,QSF),治疗DKD具有显著而明确的降低蛋白尿的疗效。为了进一步探索QSF改善DKD蛋白尿的机制,本研究以“脾不升清”精微下注及“脾为之卫”与免疫相关为切入点,以自发性T2DM模型db/db小鼠为研究载体,以Nrf2/HO-1/NLRP3炎性小体通路为研究主线,从脾不主卫与脾不升清,探讨二者相互关系及QSF干预DKD蛋白尿、足细胞损伤、肾脏炎症反应与氧化应激调控四个方面的作用与机制。目的:1.观察QSF对db/db小鼠蛋白尿与足细胞损伤的作用。2.探索QSF对db/db小鼠肾皮质Nrf2/HO-1/NLRP3炎性小体通路的调控机制。3.为QSF治疗DKD提供现代科学依据,并进一步丰富“脾为之卫”与“脾主升清”的理论内涵。方法:1.动物模型与分组:将58只6周龄雄性db/db小鼠与10只同窝野生型小鼠适应性饲养2周。随机取10只db/db小鼠作为8周龄对照组(db/db-8week),于称重、收集尿量、检测空腹血糖(FBG)后,采用异氟烷气雾麻醉,取血液及肾脏。将剩余48只db/db小鼠随机分为4组(n=12),分别为模型组(予蒸馏水,db/db+Vehicle,db/db+Veh)、氯沙坦组(予氯沙坦水溶液,db/db+Losartan 6.5mg/kg,db/db+Los)、QSF 低剂量组(予 QSF 水溶液,db/db+QSF20.15g/kg,db/db+QSF-L)、QSF高剂量组(予QSF水溶液,db/db+QSF 60.45g/kg,db/db+QSF-H)。10只野生型小鼠作为正常对照组(予蒸馏水,wide-type+Vehicle,WT)。每日给药1次,给药体积为10mL/kg,给药持续12周。2.肾功能及糖脂代谢评价:于干预第0、4、8、12周收集24h尿液,于干预第0、6、12周检测FBG,于干预12周末使用异氟烷气雾麻醉后,取血及双肾,称取肾重,计算肾重指数(KI)=肾重/体重(g/kg)。使用Elisa试剂盒检测尿微量白蛋白浓度,使用全自动生化仪检测血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、尿肌酐,计算尿白蛋白排泄(UAE)、蛋白肌酐比(ACR)、肌酐排泄率(Ccr)。3.肾脏病理形态及足细胞损伤评价:采用HE染色观察肾脏组织的一般形态改变,采用PAS及Masson染色观察细胞外基质(ECM)沉积与肾脏纤维化改变,并定量分析肾小球体积(GV);采用透射电镜观察足细胞及肾小球基底膜(GBM)等超微结构,定量分析GBM厚度及足突密度;采用免疫荧光与反转录聚合酶链反应(PT-PCR)检测podocin、synaptopodin的蛋白与基因水平,评估足细胞损伤;采用RT-PCR检测肾皮质中FN1与Col-Ⅳα3的mRNA表达。4.肾脏组织NLRP3炎性小体激活及炎症反应评价:采用Western blot检测肾皮质NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1的蛋白水平;采用免疫荧光双染色检测caspase-1与synaptopodin的共定位;采用Luminex液相悬浮芯片或Elisa试剂盒检测血清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α及MCP-1的水平;采用RT-PCR检测肾皮质 NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 的 mRNA 相对表达量;采用免疫组化检测肾脏组织F4/80蛋白表达以评估巨噬细胞浸润程度。5.肾脏组织抗氧化应激因子及Nrf2/HO-1检测:采用比色法等检测肾皮质SOD、GSH的水平;采用RT-PCR检测肾皮质中Nrf2、HO-1的mRNA表达。结果:1.QSF对db/db小鼠肾功能的影响:(1)肾重与KI:与WT小鼠相比,8周龄组及模型组db/db小鼠肾重明显增加(分别为P<0.05,P<0.01)。与8周龄组db/db小鼠相比,模型组小鼠肾重增长了 1.5倍(P<0.01),且KI明显升高(P<0.01)。与模型组小鼠相比,氯沙坦与QSF高剂量组KI显著降低(分别为P<0.05,P<0.01)。(2)肾功能(Scr、BUN、Ccr):与WT小鼠相比,8周龄db/db小鼠Scr明显降低(P<0.01),Ccr水平明显升高(P<0.01),而模型组Scr、Ccr均未见显著差异(P>0.05)。与8周龄db/db小鼠相比,模型组小鼠Scr升高达66.6%(P<0.01),Ccr降低至59.8%(P<0.05)。与模型组小鼠相比,各给药组Scr、Ccr均未见显著差异(P>0.05)。各组小鼠的BUN水平无统计学差异(P>0.05)。(3)24h尿量及尿白蛋白排泄:实验期间,db/db小鼠各时间点的24h尿量、UAE、ACR均明显高于WT小鼠(P<0.01)。氯沙坦组小鼠24h尿量在各时间点均低于模型组小鼠,但无统计学差异(P>0.05),QSF给药无明显降低尿量的趋势(P>0.05);给药第12周,氯沙坦组与QSF高剂量组UAE与ACR均显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),低剂量QSF仅降低UAE(P<0.05)。2.QSF对db/db小鼠糖脂代谢的作用:与WT小鼠相比,8周龄与模型组db/db小鼠血清FBG、CHOL、TG、LDL-C均明显较高(P<0.05或P<0.01),8周龄小鼠LDL-C、HDL-C高于模型组(P<0.05或P<0.01);氯沙坦与QSF均无降低FBG、CHOL、TG和LDL-C的趋势(P>0.05)。3.QSF对db/db小鼠肾脏病理形态及足细胞损伤的影响:(1)病理形态变化:与WT小鼠相比,模型组db/db小鼠肾小球肥大(P<0.01),肾小球系膜细胞广泛性增生,ECM增多,肾脏纤维化明显。氯沙坦组及QSF组肾小球体积明显减小(P<0.01),仅见少量系膜细胞增生及ECM增多,肾脏纤维化明显改善。(2)超微结构观察:WT小鼠GBM厚度均匀,足突形态规则、排列紧密。与WT组小鼠相比,8周龄db/db小鼠表现出明显的足突肿胀、形态不规则,未见明显足突融合、脱落,但足突密度降低(P<0.01),GBM未见明显增厚(P>0.05);模型组小鼠GBM均质性增厚(P<0.01),足突广泛性融合、脱落,足突密度均明显降低(P<0.01)。与8周龄db/db小鼠相比,模型组小鼠GBM厚度明显增加(P<0.01),足突密度并无明显差异(P>0.05)。经过药物干预12周之后,氯沙坦组与QSF组GBM厚度明显降低(P<0.01),足突融合、脱落得到改善,足突密度增加(P<0.01),以QSF组GBM增厚改善更为明显(P<0.01)。(3)podocin 与 sypaptopodin 的蛋白与 mRNA 表达:WT 小鼠的 podocin、synaptopodin均呈连续、弯曲、清晰的线性分布。与WT小鼠相比,8周龄db/db小鼠podocin、synaptopodin荧光染色未见明显异常;模型组小鼠podocin、synaptopodin的荧光染色呈现出断续、模糊的形态,且平均荧光强度弱于WT小鼠(P<0.01)。与模型组小鼠相比,氯沙坦及QSF组小鼠podocin、synaptopodin的平均荧光强度均明显增强(P<0.05或P<0.01),在整体表达形态上也显示出了肉眼可见的改变。与WT正常小鼠相比,8周龄与模型组db/db小鼠podocin、synaptopodin的mRNA表达均明显升高(分别为P<0.05,P<0.01)。与8周龄小鼠相比,模型组db/db小鼠podocin、synaptopodin的mRNA表达均明显降低(P<0.05)。氯沙坦及QSF给药均不同程度地升高了 podocin与synaptopodin的表达,但没有统计学意义(P>0.05)。(4)肾脏Col-Ⅳα3与FN1的mRNA表达:与WT组小鼠相比,模型组db/db小鼠肾皮质FN1、Col-Ⅳα3的mRNA表达均明显升高(P<0.01),且均高于8周龄小鼠(P<0.01)。经过12周给药干预,氯沙坦及QSF均降低了其表达(P<0.01)。4.QSF对db/db小鼠肾脏NLRP3炎性小体及炎症反应的抑制作用:与WT小鼠相比,8周龄与模型组db/db小鼠肾皮质NLRP3、ASC、caspase-1蛋白与mRNA 表达呈现不同程度地升高(P<0.05 或 P<0.01),caspase-1 与 synaptopodin共定位表达增加(P<0.05),肾皮质IL-1β、GSDMD的mRNA表达增加(P<0.05或P<0.01),血清IL-1β、IL-18水平升高(P<0.05或P<0.01);8周龄db/db小鼠血清IL-6升高(P<0.05),模型组小鼠血清TNF-α与MCP-1显著升高(P<0.05或P<0.01),且高于8周龄小鼠(P<0.05)。给药干预后,氯沙坦可以显著抑制肾皮质NLRP3、caspase-1的蛋白与mRNA表达、caspase-1与synaptopodin的共定位表达及血清IL-18水平(P<0.05或P<0.01)。QSF可以显著抑制肾皮质NLRP3、ASC、caspase-1的蛋白与mRNA表达,caspase-1与synaptopodin的共定位表达,以及IL-1β、GSDMD的mRNA表达(P<0.05或P<0.01),降低血清IL-1β、IL-18、MCP-1水平(P<0.05),并抑制肾皮质F4/80表达(P<0.05),改善巨噬细胞浸润。5.QSF对db/db小鼠肾脏氧化应激因子及Nrf2/HO-1的影响:与WT小鼠相比,8周龄db/db小鼠肾皮质SOD、GSH水平及Nrf2、HO-1的mRNA表达无明显差异(P>0.05),模型组小鼠SOD、GSH水平及HO-1的mRNA表达显著降低,Nrf2的mRNA表达显著升高(P<0.05或P<0.01)。经过12周给药干预,氯沙坦与QSF均可以不同程度的升高db/db小鼠肾皮质SOD、GSH水平(P<0.05或P<0.01)及 HO-1 的 mRNA 表达(P<0.05)。结论:1.8周龄db/db小鼠已经表现出显著的糖脂代谢紊乱及尿蛋白增加,肾小球、足细胞肿大。肾脏NLRP3炎性小体激活,血清部分炎症因子水平升高,但肾脏抗氧化应激因子未见显著改变。db/db小鼠肾脏炎症反应早于氧化应激。2.QSF可以显著降低db/db小鼠的尿蛋白排泄,降低UAE、ACR水平,并延缓db/db小鼠后期体重的下降趋势。3.QSF可以显著改善db/db小鼠的肾小球肥大、GBM增厚及ECM增加,改善足细胞损伤,增加足细胞标记蛋白podocin、synaptopodin的蛋白与基因表达,抑制FN1、Col-IV α3基因表达,改善肾脏纤维化。4.QSF可以抑制db/db小鼠肾脏NLRP3炎性小体及下游炎症因子的激活,改善肾脏巨噬细胞浸润程度,抑制免疫应答,改善炎症级联反应。5.QSF可以不同程度的增加db/db小鼠肾皮质SOD与GSH水平,以及Nrf2/HO-1的基因表达,增加db/db小鼠的肾脏抗氧化应激能力。6.QSF以“升清降浊”为核心理论,可能通过调节“脾为之卫”与“脾主升清”的功能,调控Nrf2/HO-1/NLRP3炎性小体介导的氧化应激与免疫炎症反应,从而改善db/db小鼠足细胞损伤,降低尿蛋白排泄。