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人类精子冷冻技术广泛应用于辅助生殖领域中男性生育力的保存。随着男性不育患者日益增加,如何保存严重少弱精子症、逆行射精患者及无精子症患者穿刺所获得的微量精子样本开始受到重视。常规冷冻方法中使用的渗透性冷冻保护剂会产生高渗冲击,在添加和去除过程中对精子遗传物质有不利影响,且复苏后的离心洗涤精子以去除冷冻保护剂的过程中会丢失很大比例的精子,不能有效冻存微量精子。玻璃化冷冻方法降温速率快,能有效减少冰晶的形成;可不使用渗透性冷冻保护剂,避免了渗透压的剧烈变化及减少复苏后复杂的处理程序,提高复苏后的存活率、活力及DNA完整性。因此,运用合适的载体玻璃化冷冻微量精子成为辅助生殖领域研究的热点。目的:通过对微量的精子使用自制封闭式冷冻载杆,加或不加冷冻保护剂进行玻璃化冷冻,检测冷冻前、复苏后精子的参数、DNA完整性、线粒体膜电位水平及复苏后精子24小时生存力,并与常规快速冷冻方法进行分析比较,从而探讨自制冷冻载杆、冷冻保护剂蔗糖对微量精子玻璃化冷冻的复苏效果,为玻璃化冷冻微量精子的可行性提供依据。方法:1正常精子冷冻:标本收集于2015年1月至2015年10月在河北医科大学第二医院生殖医学科就诊患者精液标本19例。患者禁欲2~7d,手淫留取精液于无毒量杯内,根据世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册第五版进行精液常规分析,选用标准为:精子浓度>40×10~6/ml,活动率>50%,精液量>1.5ml。所有标本均经梯度密度离心法预处理后分为5组:A组,新鲜对照组;B组,常规精子冷冻+保护剂冷冻组;C组:微量精子玻璃化+保护剂冷冻组;D组,微量精子玻璃化+蔗糖冷冻组;E组,微量精子玻璃化冷冻组(无冷冻保护剂)。B组使用1.8ml冷冻管行常规快速冷冻,C、D、E组使用自制封闭式冷冻载杆行玻璃化冷冻。冻存24h后复苏冷冻精子标本,检测并两两比较各项参数:存活率、总活力、PR、DNA完整性、线粒体膜电位(MMP)、复苏后24h总活力、复苏后24h PR、复苏后24h总活力比值和复苏后24h PR比值。2附睾精子冷冻:标本来自2015年1月-2015年10月于河北医科大学第二医院生殖医学科接受PESA+ICSI治疗的5例梗阻性无精子症患者。标本经洗涤后分为4组:F组,新鲜对照组;G组,微量附睾精子玻璃化+保护剂冷冻组;H组,微量附睾精子玻璃化+蔗糖冷冻组;I组,微量附睾精子玻璃化冷冻组(无冷冻保护剂)。附睾精子均采用自制封闭式冷冻载杆行玻璃化冷冻。冻存24h后复苏冷冻附睾精子标本,检测并两两比较各项参数(存活率、总活力、PR及DNA完整性)。3睾丸精子冷冻:标本均来自2015年1月-2015年10月于河北医科大学第二医院生殖医学科接受TESA+ICSI治疗的6例无精子症患者。标本经洗涤并温育后分为4组:J组,新鲜对照组;K组,微量睾丸精子玻璃化+保护剂冷冻组;L组,微量睾丸精子玻璃化+蔗糖冷冻组;M组,微量睾丸精子玻璃化冷冻组(无冷冻保护剂)。冻存24h后复苏冷冻睾丸精子标本,检测活动力。结果:1正常精子冷冻组:(1)冷冻组复苏后存活率、总活力、DNA完整性、MMP及24h总活力均低于新鲜对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05);(2)B组与D组复苏后的存活率、总活力、DNA完整性、MMP、24h总活力分别为55.00(8.00)vs 55.00(8.00),34.00(7.80)vs 26.80(11.20),94.00(3.00)vs 94.00(2.00),49.10(6.80)vs 46.60(9.10),20.40(6.80)vs 18.50(8.2),两组比较均无统计学差异(P>0.05);(3)C组、D组、E组三组冷冻复苏后的存活率、总活力、PR及MMP分别为44.00(5.00)vs 55.00(8.00)vs42.00(8.00),18.90(7.10)vs 26.80(11.20)vs 17.90(6.60),13.90(6.70)vs25.4(12.7)vs 13.20(5.60),40.10(8.30)vs 46.60(9.10)vs 35.40(5.4),D组均高于C组、E组,差异有统计学意义(P均<0.05);(4)C组复苏后DNA完整性高于E组,差异有统计学意义[95.00(2.00)vs92.00(3.00),P<0.05]。2附睾精子冷冻组:(1)不同方法微量附睾精子玻璃化冷冻复苏后的存活率分别为G组18.00(7.00),H组26.00(2.00),I组23.00(2.00),三组比较无统计学差异;(2)G组的DNA完整性低于H组、I组,差异有统计学意义[12.00(3.00)vs 26.00(2.00)vs 26.00(4.00),P均<0.05]。3睾丸精子冷冻组:不同方法微量睾丸精子玻璃化冷冻复苏后均可见活动精子。结论:微量精子玻璃化+蔗糖冷冻复苏后各项参数(存活率、总活力、PR、MMP及DNA完整性)均可达到常规冷冻方法的效果;微量精子玻璃化+蔗糖冷冻体积更小,冷冻过程中避免了渗透性保护剂的细胞毒性,复苏后无需进一步处理以去除冷冻保护剂,操作简便,且使用的封闭式载体有效避免了样本在液氮内潜在的交叉污染。微量精子玻璃化冷冻可推荐应用于辅助生殖领域中的精子冷冻,特别在极少量精子情况。