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应激(stress)是指机体受到体内外各种环境因素刺激时所作出的特异性和(或)非特异性反应。作战应激反应(combat stress reaction,CRS)是指遭受战争环境刺激的军人常常丧失应付正常生活能力,并伴有精神障碍；作战应激反应若得不到干预会导致创伤后应激性障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)。从美军一战、二战、越战到海湾战争看出,作战应激可能导致许多的应激性疾病,包括泌尿生殖系统疾病,是部队非战斗减员的主要因为之一。疼痛是由伤害性刺激引起的一种应激反应,也是战争创伤引起的常见症状.急慢性疼痛,特别是慢性疼痛不仅对士兵的身体,而且对他们的心理也产生很大的影响,严重影响军队的战斗力。
文献报道,多种形式的应激均能导致血浆糖皮质激素水平迅速增加,睾酮水平降低,抑制生殖功能,甚至导致不育。Annexin5是一种钙离子依赖性磷脂酰丝氨酸结合蛋白,在组织中有广泛的分布,包括睾丸间质细胞和支持细胞。Annexin5具有多种功能,如抗炎、抗凝血、蛋白激酶C(PKC)抑制剂等。Kwaminami et al发现GnRH能促进垂体促性腺细胞中annexin5的表达,调节FSH和LH的分泌,提示annexin5可能参与并调节精子发生的过程。因此,本研究通过建立急慢性两种不同动物模型模拟战争创伤引起的疼痛,即:福尔马林(formalin)致炎的急性疼痛模型和坐骨神经选择性损伤(spared nerve injury,SNI)引起的慢性疼痛模型,观察应激对雄性SD大鼠生精功能及睾丸内annexin5定位及表达的变化,为进一步研究应激对生殖的干扰及制定对应激所致的生殖损害的保护策略提供实验依据。
本研究以福尔马林注射后1h,6h,24h,72h作为福尔马林致炎急性疼痛应激模型,发现不同时间段应激后,大鼠体重、睾丸重量、睾丸指数、附睾重量、精子计数和睾丸形态结构均无显著变化(P>0.05)。但是,附睾指数在福尔马林注射后1h,6h,24h显著高于对照组(P<0.05)。免疫组化染色显示,在福尔马林注射后1h,3β-HSD表达显著低于对照组(P<0.05),6h,24h3β-HSD表达逐渐增加,到72h时恢复到对照水平。急性疼痛应激不同时间段,annexin5的定位没有明显变化。福尔马林注射后1h annexin5蛋白和对照组相比显著降低(P<0.05),6h、24h逐渐升高,72h显著高于对照组(P<0.05)。Annexin5在mRNA水平变化和蛋白水平变化一致,但不同时间段与对照组相比均无显著差异。
以坐骨神经分支选择性损伤诱导疼痛14d,21d,28d作为慢性疼痛应激,结果发现:14d和21d手术组大鼠体重均低于对照组,但和同期对照组相比无显著差异(P>0.05)。不同时间段各组大鼠睾丸和附睾系数均无明显变化。28d后手术组附睾尾精子相对计数显著低于对照组(P<0.05)。HE染色显示,坐骨神经分支选择性损伤诱导疼痛应激28d后睾丸生精上皮中生精细胞减少,生精小管腔内精子数量减少。Western blot结果显示28d手术组3β-HSD表达显著低于对正常照组和假手术组(P<0.05)。慢性疼痛应激14d和21d后,手术组大鼠睾丸almexin5在支持细胞定位减少。在蛋白质水平,Annexin5在应激后14d和21d表达显著降低(P<0.05),到28d恢复到对照组水平。在mRNA水平,坐骨神经分支选择性损伤后14 d armexin5 mRNA显著低于同期对照组,随后逐渐增加,到28 d恢复到正常生理水平。
结论:(1)急慢性疼痛应激状态下,雄性SD大鼠睾丸的生精功能受到了不同程度的影响,表现为:急性疼痛应激状态下,睾丸内3β-HSD的表达减少,睾丸分泌功能降低；慢性疼痛应激状态下,附睾尾精子相对计数减少,生精小管中生精细胞减少,睾丸内3β-HSD表达减少。(2)疼痛应激能诱导睾丸内annexin5在蛋白质和mRNA水平在不同时间点可能发生量的变化。急性疼痛应激状态下annexin5蛋白含量随时间先显著降低而后显著增加。慢性疼痛应激状态下annexin5蛋白质含量和mRNA是先显著减少,后增加恢复到对照组水平。这提示armexin5可能作为一个应激因子介导了应激对生殖功能的抑制。