论文部分内容阅读
目的：研究HBXIP在LPS诱导的TLR4信号转导通路中发挥的作用；阐明HBXIP在TLR4转运和降解过程中的重要作用及其机制。方法：1.构建pcmv-mHBXIP真核表达质粒,并测序鉴定。2.定量PCR与Western blot的方法检测HBXIP的表达规律,分析LPS刺激下HBXIP的表达变化。3.以小鼠巨噬细胞系Raw264.7为细胞模型,建立HBXIP高表达和表达抑制的稳定转染细胞系,用定量PCR和Western blot的方法鉴定HBXIP高表达和表达抑制的稳定转染细胞系。4.用定量PCR和ELISA方法检HBXIP高表达的Raw264.7细胞系以及HBXIP表达抑制的Raw264.7细胞系中IL-6、IL-1β、TNF-β等炎症因子的表达情况；用Western blot的方法检测LPS诱导下NF-κB信号通路以及MAPKs信号通路的变化(包括KKα/β、IκBα、p65、JNK、Erk、p38、IRF3等)。5.通过免疫共沉淀的方法,检测HBXIP和TLR4的直接作用；通过FACS分析巨噬细胞表面TLR4的表达变化；通过Western blot的方法检测TLR4蛋白水平,用定量PCR检测TLR4的转录水平变化。6.通过Western blot的方法检测HBXIP高表达的Raw264.7细胞系以及HBXIP表达抑制的Raw264.7细胞系中LC3Ⅱ的表达情况以及mTOR信号通路的变化。7.采用流式细胞术分析HBXIP对巨噬细胞溶酶体数量以及溶酶体pH的影响。8.利用激光共聚焦,定位分析HBXIP高表达的Raw264.7细胞系以及HBXIP表达抑制的Raw264.7细胞系中TLR4与溶酶体以及自噬小体的共定位。9. Western blot方法检测HBXIP对巨噬细胞中转录因子EB (transcription factor EB, TEFB)的磷酸化水平的影响；利用激光共聚焦分析HBXIP对TFEB核转位的影响。10.电镜观察HBXIP高表达和表达抑制的稳定转染细胞系中溶酶体的形态。11.用TFEB siRNA, Rab7 siRNA, mTORCl的激动剂Cycloheximide(CHX),溶酶体活性抑制剂Chloroquine diphosphate (CQ),自噬溶酶体融合抑制剂Vinblastine处理巨噬细胞,Western blot方法检测HBXIP对TLR4蛋白水平的影响。结果：1. HBXIP在LPS的刺激下呈现时间依赖性。2. HBXIP能够使IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等促炎因子的表达显著下调,HBXIP能减弱LPS诱导下NF-κB信号通路以及MAPKs信号通路的磷酸化。3. HBXIP对TLR4的蛋白水平有靶向调控作用,HBXIP过表达能够显著抑制TLR4的蛋白表达。4. HBXIP过表达能促进LC3Ⅱ的表达,抑制mTOR信号通路的相关蛋白的表达水平,促进细胞自噬。5. HBXIP过表达能减少TFEB的磷酸化水平,促进其核转位,从而影响溶酶体的数量和功能。过表达HBXIP后,再用自噬溶酶体相关抑制剂处理,HBXIP对TLR4的下调作用消失。结论：HBXIP通过促进转录因子TFEB的活化,提高了溶酶体以及自噬溶酶体的活性,促进TLR4的内吞和降解,抑制了LPS诱导的IL-6, IL-1β, TNF-α以及IFN-β炎症因子的分泌。我们认为HBXIP是一个新的TLR4信号转导的负向调控分子。