黄蓝状菌Talaromyces flavus内切β-1,3-葡聚糖酶的纯化、特性及抗菌活性

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近年来,化学农药的“3R”(resistance, residual and resurgence)问题日益突出,生物防治作为病害综合治理的一个重要环节,与可持续农业有良好的相融性和一致性,已在世界范围内受到人们的极大关注。菌寄生是菌寄生真菌(Mycoparasites)与寄主真菌之间的一种寄生方式,是自然界普遍存在的一种真菌-真菌之间的相互作用。菌寄生菌与寄主真菌相互作用过程中,可诱导产生一系列的胞外细胞壁降解酶类(如几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶、脂酶等),降解并穿透寄主真菌的细胞壁。因此,菌寄生菌是一类具有重要的理论和应用价值的真菌,它们不仅对植物病害有防治潜力,而且对阐明真菌间的寄生现象及信号传导有重要意义。黄蓝状菌(Talaromyces flavus)是一种常见的菌寄生真菌,对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等多种病原菌产生的菌核有重寄生作用,此外对大丽轮枝菌(Verticillum dahliae)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum)等有明显的抑制作用。黄蓝状菌与寄主真菌互作中,诱导产生几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶等多种胞外水解酶和葡萄糖氧化酶。由于大多数真菌的细胞壁是由几丁质和β-1,3-葡聚糖组成的,因而几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶被认为是一类重要的抗真菌蛋白。本研究表明黄蓝状菌T. flavus经诱导培养,可产生至少3种细胞壁降解相关的酶,即几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶,但该菌不产生蛋白酶;各酶诱导产生的高峰并不一致,β-1,3-葡聚糖酶在培养7d后达到高峰,而几丁质酶和纤维素酶则需9~10d。黄蓝状菌T. flavusβ-1,3-葡聚糖酶的诱导培养基,碳源可选用适当病原菌的细胞壁碎片,但高浓度的葡萄糖对产酶有强烈的抑制作用;氮源以酵母膏为最佳。产酶最适培养温度为28~30℃;培养基初始pH对产酶有较大影响,产酶适宜pH范围为5.0~6.0,最适宜pH为5.5。黄蓝状菌在SMF(Synthetic medium with fungal cell walls as carbon sources)液体培养基中置于恒温摇床(200r/min,28℃)上培养7d,诱导产生大量的β-1,3-葡聚糖酶。培养滤液经硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose Fast Flow<WP=8>阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析、Sephacryl S-100分子筛层析得到了凝胶电泳(SDS-PAGE)谱带单一的β-1,3-葡聚糖酶。经12% SDS-PAGE和凝胶过滤层析,测得其分子量约为41.0~42.6kD。糖染色反应即过碘酸-Schiff试剂染色表明, 纯化的β-1,3-葡聚糖酶为单链糖蛋白。经薄层层析进一步证明,该酶为内切β-1,3-葡聚糖酶。本研究对β-1,3-葡聚糖酶的基本性质及其抑菌活性进行了测定,结果表明:β-1,3-葡聚糖酶最适反应温度为40℃,最适pH值范围为4.0~4.5之间。β-1,3-葡聚糖酶热稳定性较差,当温度超过45℃,酶开始丧失部分活性;60℃保温30min,其活性仅为原来的20%;在酸碱稳定性方面,pH< 6.5时酶较稳定,反应的最适pH值为4.0~4.5,当pH = 4.5时活性最高。Michaelis-Menten动力学分析得出,纯化的β-1,3-葡聚糖酶Km、Vmax分别为1.74mg/mL和0.176mg/mL·min。Na2+、Ca2+、Mn2+等对β-1,3-葡聚糖酶具有一定的激活作用,Hg2+、Cu2+、Ag+等对该酶具有强烈的抑制作用。抗菌活性显示,β-1,3-葡聚糖酶对供试病原菌具有不同程度的抑制作用,其中对烟草赤星病菌、核盘菌和黄瓜枯萎病菌的抑制作用明显;而对串珠镰刀菌和苹果炭疽病菌抑制作用微弱。
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