目的:原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,居我国恶性肿瘤发病率的第三位,死亡率的第二位。由于原发性肝癌发病隐匿、进展迅速,90%以上的患者确诊时已处于进展期。因此,肝癌病人手术切除率低,即使接受手术,复发率也较高。目前常用的肝癌化疗药物敏感性差、毒副作用大,而且多数病人合并肝硬化,耐受性差,治疗效果不佳。因此,寻找高效、副作用小的药物具有重要的临床意义。巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1,BafA1)是一种特异性囊泡型H+-ATP酶(V-ATPase)抑制剂,属于大环内酯类抗生素,常以高浓度(0.1-1μM)用作自噬晚期抑制剂。已发现BafA1对多种肿瘤细胞具有细胞毒性,然而为了有效抑制肿瘤细胞生长及抑制细胞自噬,通常需要较高浓度(0.1-1μM),进而导致正常组织发生严重的酸中毒,产生较强的毒副作用,这阻碍了Baf A1在肿瘤临床治疗中的应用。本课题旨在研究5nM BafA1对肝癌细胞的实验性治疗作用,并深入探讨其具体作用分子机制,为BafA1成为肝癌治疗的靶向新药的进一步研究提供研究基础及理论依据。本项研究拟解决以下三个问题:(1)明确5nM BafA1对肝癌细胞增殖的抑制作用;(2)确定BafA1对活体肝癌皮下移植瘤裸鼠模型的治疗作用;(3)探讨BafA1诱导肝癌细胞死亡的具体分子机制。方法:1、BafA1对肝癌细胞的生长抑制作用应用MTT法及克隆形成实验检测在二维培养条件下5nM BafA1对肝癌细胞生长的影响,通过细胞微球形成实验在三维培养条件下检测5nmbafa1对肝癌细胞微球形成的影响及对微球细胞的毒性作用。2、bafa1对裸鼠皮下肝癌细胞移植瘤的生长抑制作用裸鼠皮下注射肝癌细胞建立皮下移植瘤裸鼠模型。建模成功的裸鼠分四组:对照组,jnk抑制剂组,bafa1组,bafa1与jnk抑制剂联用组,根据肿瘤体积确定bafa1对裸鼠皮下肝癌细胞移植瘤的生长抑制作用。另外,取治疗后肿瘤组织,石蜡切片,进行he染色和tunel染色,分析bafa1对肿瘤组织产生的病理改变。3、bafa1对细胞周期的调控应用流式细胞术pi单染法检测bafa1对细胞周期分布的影响,蛋白免疫印迹法检测细胞周期调节蛋白表达水平的变化,应用抑制剂抑制、sirna干扰的手段,通过蛋白免疫印迹检测cyclind1表达水平的变化以及mtt法检测细胞增殖情况,明确bafa1引起肝癌细胞周期阻滞的机制。4、bafa1对肝癌细胞凋亡的影响使用流式细胞术检测bafa1对肝癌细胞凋亡的影响、免疫印迹检测细胞凋亡标志蛋白caspase-3激活、parp剪切,泛caspase抑制剂抑制后观察凋亡变化,探讨bafa1诱导细胞凋亡的类型,同时通过免疫印迹法检测抑凋亡蛋白以及促凋亡蛋白的水平。5、bafa1对肝癌细胞自噬的影响应用蛋白免疫印迹法、透射电镜、共聚焦显微镜,分别用gfp-lc3质粒及双标gfp-mrfp-lc3质粒转染肝癌细胞,慢病毒构建稳定敲低lc3的肝癌细胞系及mtt法等方法探讨5nmbafa1对细胞自噬的影响及如何靶向自噬诱导肝癌细胞死亡的。6、bafa1诱导细胞死亡所靶向的信号通路应用蛋白免疫印迹法检测mapk信号通路变化、流式细胞术检测mapk抑制剂处理后细胞凋亡变化、mtt法检测慢病毒构建稳定敲低p38的肝癌细胞系、腺病毒过表达p38后细胞存活情况,探讨bafa1作用肝癌细胞后mapk通路的变化,bafa1靶向的信号通路及mapk通路调控肝癌细胞死亡的具体机制。结果:1、5nmbafa1显著抑制多种人肝癌细胞系生长和克隆形成,而对正常肝细胞无影响。bafa1作用后,肝癌细胞不能形成细胞微球;若形成微球后再用bafa1处理,随着作用时间延长细胞微球的数量和体积均减小,并且肝癌细胞微球内出现大量死亡细胞。2、bafa1对裸鼠皮下肝癌移植瘤的生长有明显抑制作用,并且与jnk抑制剂联用进一步增强这一治疗效果。单独bafa1处理或联合jnk抑制剂处理组的肿瘤组织中出现更多的炎性细胞浸润和细胞死亡。3、bafa1将肝癌细胞阻滞在g1期,下调了细胞周期正调控因子cyclind1、cdc6和prb的表达水平,并且腺病毒过表达cyclind1减弱了bafa1诱导的肝癌细胞生长抑制,表明cyclind1的降解在bafa1抑制肝癌细胞生长中起关键作用。另外,进一步发现bafa1引起的cyclind1降解依赖于dyrk1b,而与gsk3β无关。4、bafa1能够诱导肝癌细胞凋亡,但未检测到经典凋亡标志蛋白caspase-3的活化和parp的裂解,并且泛caspase抑制剂z-vad-fmk对bafa1诱导的细胞凋亡并无明显影响。因此,bafa1可能诱导肝癌细胞发生caspase非依赖型细胞凋亡。bafa1同时下调bcl2蛋白家族中的抑凋亡蛋白bcl2、bcl-xl的表达和促凋亡蛋白bax、bid及bim的表达,但puma的表达上调。5、bafa1常以高浓度用作自噬晚期抑制剂。本课题发现,bafa1除了能够通过阻滞自噬体与溶酶体的融合抑制晚期自噬外,还能通过抑制肝癌细胞系i型pi3k/akt/mtor/p70s6k信号通路的活化,诱导细胞早期自噬。并且发现,抑制自噬体形成减弱bafa1诱导的肝癌细胞死亡。表明bafa1靶向自噬诱导肝癌细胞死亡。6、除了通过靶向自噬,bafa1还通过靶向p38mapk信号通路诱导细胞死亡。bafa1处理肝癌细胞后,mapk三条主要通路均发生活化。抑制jnk的表达可显著增强bafa1诱导的肝癌细胞死亡,表明bafa1与jnk抑制剂联用可能成为肝癌治疗的潜在方案。另外,药物抑制或者稳定敲低p38显著减少bafa1诱导的肝癌细胞死亡。p38抑制剂还可以阻碍bafa1诱导的肝癌细胞中puma水平的上调。敲低puma减弱bafa1产生的细胞毒性,相反过表达puma使bafa1诱导肝癌细胞生长抑制作用明显增强,暗示p38通过调控puma水平来调控bafa1介导的肝癌细胞的细胞毒性作用。结论:纳摩尔级浓度的BafA1能够显著抑制二维、三维培养条件下以及小鼠移植瘤模型中HCC细胞的生长。BafA1通过靶向自噬和MAPK信号通路诱导非依赖caspase的肝癌细胞死亡。BafA1是一种肝癌治疗的候选药物,具有很高的研究价值和应用前景。