苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）是一种高产维生素B12的革兰氏阴性菌株,具有应用于工业生产维生素B12的能力。但是,苜蓿中华根瘤菌存在生长周期长、遗传改造困难等缺点。因此,在苜蓿中华根瘤菌中开发高效的基因编辑工具对于选育高产维生素B12菌株十分重要。基于实验室前期开发的大肠杆菌/苜蓿中华根瘤菌高拷贝质粒pkp,本研究在苜蓿中华根瘤菌中开发了基于Cas12k-Tn7样转座酶的基因整合工具SmCAST。运用该工具对phbC基因等11个靶向位点进行基因编辑,实现目标基因的整合,编辑效率最高为100%。将IPTG诱导的Cas12k和sgRNA表达盒构建到pkp质粒上,在苜蓿中华根瘤菌中开发了基于Cas12k的基因弱化工具CRISPRi。运用该工具分别靶向苜蓿中华根瘤菌中的质粒和基因组上的gfp基因模板链5’端时,荧光值均下调90%。SmCAST以及CRISPRi工具的开发为构建高产维生素B12菌株提供了有效工具。为了优化苜蓿中华根瘤菌的维生素B12代谢途径,本研究利用SmCAST以及CRISPRi工具靶向维生素B12代谢途径副产物西罗血红素的关键酶基因cysG,减少副产物西罗血红素的生成,以提高维生素B12的产量。利用Cas12k的CRISPRi工具,下调cysG基因的表达,维生素B12产量提高5%,但质粒代谢负担使菌体生长减缓20%。通过SmCAST工具阻断cysG表达,维生素B12的产量提高8%,菌体生长正常。为了进一步提高维生素B12产量,利用SmCAST工具在cysG基因开放阅读框内整合cobA基因,实现同时阻断cysG基因表达和过表达cobA基因,成功构建了高产菌株SM320-27,产量为90 mg/L,相比于野生型菌株,维生素B12的产量提高了25%。综上所述,本研究构建的Cas12k基因编辑工具在苜蓿中华根瘤菌中成功实现基因整合及弱化,为苜蓿中华根瘤菌的遗传改造奠定了基础。同时利用该工具实现了维生素B12代谢途径的优化,获得了高产菌株SM320-27,产量提高了25%,对维生素B12代谢通路的改造以及提高微生物细胞工厂生产维生素B12的产量具有一定的指导意义。