背景:近年来,过继性细胞疗法（ACT）的诞生,无疑为自身免疫性疾病和癌症患者带来了福音。尽管过继性免疫疗法在广泛的疾病类型中具有显著的临床益处,但很大一部分患者在几年内表现出疾病复发。过继免疫细胞疗法的两大阻力是:1)是过继免疫细胞如何在体外大量扩增;2)防止过继免疫细胞在体内出现功能失调,包括衰老和衰竭。为了克服这些阻力,我们希望寻找一种可以促进T细胞增殖和抑制免疫检查点表达的的小分子物质。我们从结直肠癌细胞系HCT-8的条件培养基中鉴定出了两种小分子物质——3MOBA和βNMN,当T细胞在这两种物质存在的情况下被激活,T细胞会以更快的速度增殖且低表达PD-1和CTLA-4。因为3MOBA和βNMN是价格相对低廉天然代谢物,可以简便地有效地应用到ACT疗法当中,甚至可以避免繁琐的基因工程改造。目的:1.寻找一个小分子物质能促进T细胞增殖、分化且能同时防止T细胞衰竭。2.探索其对T细胞增殖、分化、效应功能和抑制受体表达的影响。方法:1.收集不同细胞系的CM,从中筛选出可以促进T细胞增殖的细胞系:分别收集HCT-8,HCA-7、Caco-2、MEF的条件培养基,以50%的体积浓度应用T细胞的体外培养,以不加条件培养基培养的T细胞为控制对照组。刺激2-3天后根据Cell Trace Violet的荧光染料应用流式细胞技术检测T细胞的增殖情况,从而筛选出能促进T细胞增殖细胞系。2.选定一种可促进T细胞增殖的细胞系:HCT-8,HCA-7、Caco-2皆属于上皮细胞来源,它们的条件培养基皆促进T细胞增殖。因此我们选定HCT-8 CM进行后续的研究。3.通过生物化学的方法确定该促进因子为小分子物质:因为我们旨在寻找能促进T细胞增殖的小分子,所以我们需要证明HCT-8 CM中促进T细胞增殖的物质为小分子物质。因此我们通过3KD分离和凝胶分离层析等方法从HCT-8 CM中分离出小分子混合物,并证实该混合物促进T细胞的体外增殖,我们将混合物中起促进作用的分子称为LNY2。4.通过代谢组学分析条件培养基中所分泌的代谢产物:为了鉴定LNY2为何物,我们对小于3KD的HCT-8 CM进行了代谢组学分析。一共鉴定出了有27种代谢物在HCT-8 CM中富集、17种代谢物仅存在于HCT-8条件培养基中。经阅读文献后,我们从公司购买来部分代谢药物应用于T细胞的增殖和Tregs的分化,观察这些药物对T/Treg细胞活化、增殖、分化的影响。5.确定促进T细胞增殖的代谢物:根据LNY2能够长效地促进T细胞增殖、活化和分化的特性,我们通过筛选并最终确定3MOBA和βNMN即为促进T细胞增殖的小分子物质。6.鉴定3MOBA和βNMN对T细胞增殖、分化、功能和抑制受体表达的影响:首先对3MOBA和βNMN浓度进行优化,发现两种药物的联合使用优于单独使用;人T、Treg细胞经刺激,通过表面活化分子染色后,我们探索了3MOBA和βNMN对T细胞CTLA-4和PD-1的表达的影响;同时我们还进行了细胞能量代谢分析,探究3MOBA和βNMN对T细胞的呼吸代谢活动的影响。结果:1.我们从HCT-8细胞条件培养基中发现促进T细胞增殖和促进调节性T细胞分化的小分子代谢物——βNMN和3MOBA。2.βNMN和3MOBA的联合或者单一使用皆可以在体外促进人T细胞的增殖同时降低PD-1和CTLA-4分子的表达。3.3MOBA和βNMN皆促进了T细胞的呼吸代谢活动,揭示它们促进T细胞能量代谢活动的同时又能抑制T细胞的过度活化（降低PD-1和CTLA-4的表达）。4.βNMN和3MOBA促进Tregs细胞的体外增殖和分化,并增强其对靶细胞的杀伤作用。结论:βNMN和3MOBA促进T细胞的增殖、分化和功能,因此它们有望应用到ACT治疗中以获得足够数量的T细胞。