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目的:早期负性经历(early life adversity,ELA)可以引起成人的压力相关性行为表现以及对应激性损伤的易感性增加,可能与创伤后应激障碍(post traumatic stress disorder,PTSD)的发病机制有关。PTSD是指遭遇或目睹涉及自身或他人危及生命的应激性事件或处境所导致的个体延迟出现和持续存在的精神障碍。其中参与控制应激反应的下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitaryadrenal axis,HPA axis)功能失调是PTSD发病的重要特征,血液循环中的糖皮质激素(glucocorticoid,GC)通过作用于糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)参与HPA轴的负反馈调节,同时有研究报道ELA可导致HPA轴的程序化改变,所以成年后压力敏感性增强可能是由于持续的HPA轴活动改变以及GR的表达异常。富含糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)的杏仁核(amygdala)和海马(hippocampus)在HPA轴调节中起关键作用。其中杏仁核是调节条件性恐惧获得、表达和消退的关键核团,而海马作为应激反应的整合部位,是调节情绪反应和认知行为功能的重要脑区,对动物的学习记忆有着基本的作用,同时具有高度的突触可塑性。胚胎期和出生早期各种环境因素的改变均可影响海马和杏仁核突触结构的构建与功能的完善,进而导致出生后脑功能受损。突触前膜的突触素I(synapsin I)对神经递质的释放起调节作用,参与中枢神经系统神经元之间突触联系的形成和维持。突触后致密蛋白-95(postsynaptic density proteins-95,PSD-95)在突触结构、功能和可塑性等方面发挥重要作用。除synapsin I和PSD-95以外,定位于突触的细胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)在影响突触形成的同时,也可以通过与其他突触蛋白之间的相互作用,参与信号级联反应调节突触之间的信号传递,影响突触功能。如neurexin I和neuroligin-1/-2可以通过影响大脑中兴奋性和抑制性神经传递之间的平衡,改变海马和杏仁核神经元长期的记忆储存和恐惧调节,进而导致认知功能障碍。因此我们提出“新生隔离”(neonatal isolation,NI)这种短期重复隔离模式作为早期的心理应激源,是否会通过GR受体引起单一连续应激(single prolonged stress,SPS)方法构建的成年PTSD模型大鼠海马和杏仁核神经元突触稳态的改变,影响兴奋性/抑制性突触的比例以及兴奋和抑制电流平衡,进而导致脑神经网络连接的异常,影响成年后的情感、认知及学习记忆能力,构成PTSD的易感性因素。本研究通过三种行为学实验,旷场实验(open field test,OF),高架十字迷宫(elevated plus maze test,EPM)及Morris水迷宫(morris water maz,MWM)检测NI-SPS大鼠的自发性探索行为、焦虑程度和空间学习记忆能力。从形态学,蛋白水平,基因水平来探索GR及synapsin I、PSD-95、neurexin I、neuroligin-1/-2在NI和SPS大鼠海马、杏仁核的表达变化。结合NI-SPS大鼠的行为学测定,研究ELA是否可以通过GR调控PTSD大鼠的神经可塑性,参与大鼠应激反应、记忆与情感障碍的病理生理过程,为深入揭示PTSD的发病机制提供理论依据。研究方法:1、动物模型制作、实验分组及生理指标测量:采用的雌性Wistar孕鼠,自由摄食饮水饲养至生产,分娩的当天被指定为出生后第0天(postnatal day 0,PND 0)。本研究中共采用了100只雄性幼鼠,随机分为4组(25只/组):1)对照组:不受任何干扰;2)NI组:仅在PND 2~9接受NI处理,而不接受SPS刺激;3)SPS组:不接受NI处理,仅在PND 56给予SPS刺激;4)NI+SPS组:先在PND 2~9接受NI处理,然后在PND 56接受SPS刺激。幼鼠在PND 22断奶,在特定的时间点(PND 22,PND 40和PND 60)测量大鼠体重,从PND 63开始,对大鼠进行行为学测试和取材。2、行为学测定:通过行为学实验OF、EPM及MWM检测各组大鼠自发性探索行为、焦虑程度和空间学习记忆能力。3、免疫组织化学:应用免疫组织化学方法,从形态学角度观察各组大鼠海马和杏仁核GR、synapsin I、PSD-95免疫反应性变化。4、酶联免疫吸附测定:用ELISA试剂盒测定各组大鼠应激和焦虑时血浆皮质酮(corticosterone,CORT)水平。5、Western blotting:应用Western blotting方法检测各组大鼠海马和杏仁核部位GR、synapsin I、PSD-95、neurexin I、neuroligin-1/-2蛋白表达变化。6、Real-Time PCR:应用Real-Time PCR方法检测各组大鼠海马和杏仁核synapsin I、PSD-95、neurexin I、neuroligin-1/-2 mRNA的表达变化;7、免疫荧光技术:应用免疫荧光技术检测海马neuroligin-1/-2的表达变化。结果:1、大鼠生理指标的测量:与对照组相比,NI和SPS大鼠摄食和饮水等情况无明显变化,NI或SPS对大鼠的体重增长情况均无显著影响。2、行为学检测结果:OF实验中,无论是NI还是SPS对大鼠总体水平运动的影响均不显著,但是NI+SPS组大鼠进入中心区域的次数和运动距离百分比均显著低于NI组和SPS组;EPM实验中,SPS组大鼠的开放臂进入次数百分比和时间百分比显著低于对照组和NI组,而且NI+SPS组大鼠显著低于SPS组;MWM实验中,NI和SPS对大鼠总的运动距离影响也不显著,但是NI和SPS对大鼠经过目标位置次数和目标象限游泳距离百分比的影响是显著的,而且NI+SPS组显著高于SPS组。3、免疫组织化学检测结果:大鼠海马和杏仁核GR的免疫反应定位于神经元的细胞核和细胞浆。实验组大鼠海马GR的阳性表达较对照组均增强,但是杏仁核GR的阳性表达较对照组均减弱;Synapsin I在对照组大鼠海马和杏仁核显示的阳性反应相对淡染,主要分布在神经元的细胞膜和细胞质。NI处理后,海马和杏仁核的synapsin I免疫反应增强。SPS组大鼠海马synapsin I阳性表达增强,而杏仁核的阳性表达较对照组减弱;PSD-95抗体阳性细胞的免疫组化染色为棕色,免疫反应主要见于海马和杏仁核神经元的胞浆和突起。NI组大鼠海马和杏仁核的PSD-95阳性表达较对照组增强。同时SPS组海马PSD-95的阳性表达也增强,而杏仁核的阳性表达减弱。4、酶联免疫吸附测定结果:对照组和NI组大鼠血浆的基础CORT水平没有显著差异,而SPS导致大鼠血浆CORT水平显著升高。另外,NI+SPS组大鼠血浆CORT水平显著高于对照组和NI组大鼠。5、Western blotting检测结果:NI组和SPS组大鼠海马GR蛋白表达显著高于对照组,而杏仁核GR蛋白表达显著低于对照组,NI+SPS组同SPS组相比,海马和杏仁核GR蛋白表达的改变显著增强;Synapsin I和neurexin I蛋白在NI组和NI+SPS组大鼠海马的表达显著低于对照组,但是在SPS组的表达显著增高。而NI组和SPS组杏仁核synapsin I和neurexin I的蛋白表达显著低于对照组,而且NI+SPS组显著低于SPS组;同对照组相比,NI组和SPS组大鼠海马PSD-95的蛋白表达和neuroligin-1/-2蛋白表达的比值显著增高,而且NI+SPS组显著高于SPS组。NI组大鼠杏仁核PSD-95的蛋白表达与对照组相比显著升高,而SPS组显著降低。但是NI组和SPS组大鼠杏仁核neuroligin-1/-2的蛋白表达比例均显著低于对照组,而且NI+SPS组显著低于SPS组。7、Real Time PCR检测结果:SPS刺激后大鼠海马synapsin I mRNA的表达同对照组相比显著上调,但是在NI组和NI+SPS组的表达显著下降。NI和SPS刺激后杏仁核synapsin I mRNA的表达较对照组均显著减少;同对照组相比,实验组大鼠海马PSD-95 mRNA的表达均显著增高。NI组杏仁核PSD-95 mRNA的表达较对照组显著升高,而SPS组显著降低;经过NI和SPS刺激后,大鼠海马和杏仁核neurexin I mRNA与对照组相比均显著减少,海马neuroligin-1/-2 mRNA表达的比值均显著高于对照组,而杏仁核均显著低于对照组。7、免疫荧光技术检测结果:对照组neuroligin-1和-2在海马脑区部分细胞中高表达,不仅在细胞质中共同定位,而且在突起中也共同定位,但是轴突染色较少。NI组大鼠海马脑区大部分细胞呈极低的neuroligin-1和-2免疫反应,神经突起中未表达。而在SPS组大鼠海马中大多数细胞共同表达neuroligin-1-和-2,在许多较长的细胞突起中共同定位。在NI+SPS组大鼠海马中大多数共同表达的neuroligin-1和-2在较低水平,在细胞突起中共定位,但是在神经纤维的数目少于SPS组。结论:1、与对照组相比,NI组大鼠在焦虑方面没有表现出显著的变化,但是与SPS组大鼠相比,NI+SPS组大鼠在OF和EPM试验中表现出更高的焦虑水平,说明经历过早期应激的大鼠在成年期可能更容易受到负性经历的影响。2、早期NI并不影响成年大鼠血浆CORT水平,然而SPS组和NI+SPS组大鼠血浆CORT水平增加,那么GR就成为早期应激动物模型中HPA轴功能的关键调节因子。3、NI组和SPS组大鼠海马GR的表达水平显著增高,杏仁核GR表达的改变与海马完全相反,而且NI增加了海马和杏仁核这些改变。4、同时NI加重了SPS成年大鼠海马突触后膜和杏仁核突触前膜神经元件的变化,并且增加了海马和杏仁核兴奋性和抑制性突触比例的改变。综上所述,早期应激引起大鼠的海马和杏仁核HPA轴功能和突触可塑性改变可能会持续至机体成年,进而加重了SPS大鼠遭受创伤时中枢神经系统的变化,增加PTSD的易感性。