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目的: 唾液腺多形性腺瘤(salivary pleomophic adenoma,SPA)是人唾液腺最常见的良性肿瘤。由于肿瘤含有肿瘤性肌上皮细胞和腺上皮细胞,双层腺管结构,黏液样组织和软骨样组织而呈现多形性。唾液腺多形性腺瘤作为良性肿瘤,文献报道有复发,神经侵袭和转移的现象。手术完整切除多形性腺瘤后,并不能除外肿瘤的复发,侵袭和转移的发生。在临床上,恶性多形性腺瘤往往是由于良性多形性腺瘤,多次复发恶变而来。鉴于唾液腺多形性腺瘤临床复发,侵袭和转移的困惑,对于相关机理的研究成为热点。蛋白多糖(proteoglycans,PGs)是一种细胞外基质,参与肿瘤的发生发展。蛋白多糖合成限速酶——木糖基转移酶(xylosyltransferase,XT),其包含的两个亚型XT-I和XT-II逐渐引起研究者的兴趣。王洁课题组近十年来,一直致力于蛋白多糖与唾液腺肿瘤生物学行为关系的研究。其结果已经显示,蛋白多糖与腺样囊性癌的神经侵袭和肺转移有密切关系。本研究是国家自然科学基金资助课题。利用本实验室2002年建立的体外培养唾液腺多形性腺瘤细胞的方法,采用RNA干扰技术,将腺病毒载体Ad-sh RNA-XT-II转染多形性腺瘤细胞。在基因水平,蛋白水平上检测木糖基转移酶XT-II,并检测XT-II基因沉默后蛋白多糖合成的下降。蛋白多糖合成减少后,观察其对多形性腺瘤细胞侵袭性和迁移性的影响。本研究还利用2012年本实验室获得的一项专利技术,构建组织工程化纤维组织,建立多形性腺瘤的裸鼠移植瘤模型。在裸鼠体内观察多形性腺瘤木糖基转移酶基因XT-II阻断后,对肿瘤种植性生长生物学行为的影响。方法： 1沉默XT-II基因对唾液腺多形性腺瘤细胞蛋白多糖合成的影响采用贴壁法培养唾液腺多形性腺瘤细胞,利用免疫组织化学染色和Giemsa染色方法鉴定培养的多形性腺瘤细胞。构建针对XT-II基因的腺病毒载体(Ad-sh RNA-XT-II)转染转染多形性腺瘤细胞,分为沉默组(SPA-XT-II组)、空载体组(SPA-HK组),以第三代多形性腺瘤细胞作为未转染组(SPA组)。Real-time PCR和Western blot蛋白印迹法分别检测三组XT-II基因沉默效率和XT-II蛋白的抑制率。生物染色法检测三组XT-II基因沉默后对蛋白多糖合成的影响。2沉默XT-II基因对唾液腺多形性腺瘤侵袭性和迁移性的影响采用贴壁法培养唾液腺多形性腺瘤细胞,利用免疫组织化学染色方法鉴定培养的多形性腺瘤细胞。腺病毒介导的质粒载体(Ad-sh RNA-XT-II)转染多形性腺瘤细胞,分为沉默组(SPA-XT-II组)、空载体组(SPA-HK组),以多形性腺瘤细胞作为未转染组(SPA组)。利用transwell侵袭小室和划痕实验,分别检测蛋白多糖合成的变化对多形性腺瘤细胞的侵袭性和迁移性的影响。3沉默XT-II基因对唾液腺多形性腺瘤种植性生长的影响采用贴壁法分别培养唾液腺多形性腺瘤细胞和包膜成纤维细胞。将成纤维细胞接种于经5%氢化可的松完全培养液浸泡的脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)支架材料上,构建组织工程化纤维组织。采用HE染色和扫描电镜,观察组织工程化纤维组织的构建情况。将处于对数生长期的沉默组细胞(SPA-XT-II组),空载体组细胞(SPA-HK组)和未转染组细胞(SPA组)种植于组织工程化纤维组织上,以HE染色,免疫组织化学染色和扫描电镜方法,观察种植在组织工程化纤维组织上的多形性腺瘤细胞体外生长情况。再分别将上述三组细胞,接种于18只BALB/C-nu裸鼠背部皮下,每组6只。在裸鼠体内生长三个月后,麻醉下取出移植瘤。进行HE和免疫组织化学染色,观察多形性腺瘤在裸鼠体内种植性生长的情况。结果： 1沉默XT-II基因对唾液腺多形性腺瘤细胞蛋白多糖合成的影响1.1留取人唾液腺多形性腺瘤标本,经两名病理医师确诊为多形性腺瘤。1.2唾液腺多形性腺瘤细胞原代及传代培养贴壁法培养细胞1周,即可在倒置显微镜下可观察到组织块周围爬出细胞,大约在2周后原代培养细胞即可达到80~90%融合。传代细胞为多边形,细胞核圆形或椭圆形,可见1~2个核仁,偶见双层腺管结构。1.3唾液腺多形性腺瘤细胞鉴定Giemsa染色显示:肿瘤性腺上皮细胞多呈圆形,胞核圆形。肿瘤性肌上皮细胞呈多边形,胞核较大,可见2~3个深染的核仁。肿瘤性肌上皮细胞分泌的蛋白多糖呈紫红色颗粒,分布于细胞外。免疫细胞化学染色显示:肿瘤性肌上皮细胞对抗calponin,S-100蛋白,α-SMA均呈阳性反应。1.4腺病毒载体的构建及转染多形性腺瘤细胞1%琼脂糖凝胶结果及测序结果显示,Ad-sh RNA-XT-II目的序列与设计序列完全匹配,表明腺病毒构建成功。腺病毒介导的质粒载体(Ad-sh RNA-XT-II)转染多形性腺瘤细胞,分为沉默组(SPA-XT-II组)、空载体组(SPA-HK组)和未转染组(SPA组)。转染48小时后,细胞表达绿色荧光蛋白,其转染率近100%。未转染组细胞(SPA组)未见绿色荧光表达。1.5 Real-time PCR检测XT-II的基因沉默效率根据△△CT计算方法得到三组细胞基因相对表达量。沉默组XT-II基因m RNA表达降低43%。基因沉默组与空载体组和未转染组相比具有统计学差异(P<0.05)。1.6 Western blot检测XT-II蛋白含量Gene Tool检测Western blot样本条带相对定量分析结果显示:沉默组中,XT-II蛋白相对表达量为0.44±0.09;空载体组中XT-II蛋白相对表达量为0.86±0.16;未转染组中XT-II蛋白相对表达量为0.77±0.11。沉默组比较未转染组XT-II蛋白相对表达量降低34%。空载体组未见XT-II蛋白表达降低。1.7多形性腺瘤细胞蛋白多糖合成量检测细胞转染48小时后,1×106细胞分泌蛋白多糖含量为:沉默组47.78±3.16μg;空载体组77.58±2.01μg;未转染组81.18±2.80μg。沉默组比较未转染组蛋白多糖合成量降低41.14%。空载体组比较未转染组蛋白多糖合成量降低4.43%。单因素方差分析结果显示:沉默组分别与空载体组、未转染组有统计学差异(P<0.05),空载体组和未转染组未见明显差异。2沉默XT-II基因对唾液腺多形性腺瘤细胞侵袭性和迁移性的影响2.1唾液腺多形性腺瘤细胞原代及传代培养,鉴定和转染同第一部分。2.2 Transwell侵袭小室检测多形性腺瘤细胞侵袭性经转染48小时后的沉默组细胞,空载体细胞组和未转染组细胞经过96小时培养,各组细胞穿过微孔膜的细胞数为:沉默组14.40±2.50;空载体组39.90±4.61;未转染组40.80±4.63。沉默组细胞侵袭性抑制率64.70%,空载体组细胞侵袭性抑制率2.21%。单因素方差分析结果显示,沉默组与空载体组、未转染组比较差异有显著性,空载体组与未转染组比较差异无显著性。2.3划痕实验检测多形性腺瘤细胞的迁移能力转染48小时后,细胞进行划痕实验。继续培养96小时,细胞爬过致伤区的距离显示:沉默组262.27±219.50像素;空载体组1166.17±276.94像素;未转染组956.83±212.04像素。沉默组细胞迁徙抑制率为72.60%。空载体组未见明显细胞迁移抑制。单因素方差分析显示:沉默组与空载体组、未转染组差异有显著性,空载体组与未转染组差异无显著性。3沉默XT-II基因对唾液腺多形性腺瘤种植性生长的影响3.1唾液腺多形性腺瘤细胞培养鉴定结果同第一部分。3.2唾液腺多形性腺瘤包膜成纤维细胞的培养。贴壁培养多形性腺瘤包膜成纤维细胞呈细长梭形,排列成放射状或漩涡状。免疫细胞化学及免疫荧光化学染色显示:人成纤维细胞对抗vimentin表达阳性。3.3细胞转染:同第一,二部分。3.4组织工程化纤维组织的观察HE染色及扫描电镜观察显示,成纤维细胞成功接种于ADM支架上。3.5组织工程化纤维组织种植多形性腺瘤细胞的体外观察沉默组细胞(SPA-XT-II组),空载体组细胞(SPA-HK组)和未转染组细胞(SPA组)接种于组织工程化纤维组织上,同样命名为沉默组(SPA-XT-II组),空载体组(SPA-HK组)和未转染组(SPA组)。HE,免疫组织化学,扫描电镜观察显示,成纤维细胞平铺排列,肿瘤细胞分布于成纤维细胞之间。沉默组可见肿瘤细胞“抱团”分布现象,空载体组和未转染组可见肿瘤细胞位于成纤维细胞之间。3.6组织工程化纤维组织上种植的多形性腺瘤在裸鼠体内生长的观察3.6.1在裸鼠体内生长3个月后,麻醉下取出移植瘤。肉眼观察发现,三组的支架组织在裸鼠体内,与裸鼠的血管和组织粘连。肉眼观察未发现明显的肿瘤瘤体。3.6.2组织学观察结果3.6.2.1 HE染色发现,SPA-XT-II组可见裸鼠脂肪细胞长入组织工程化纤维组织中,并可见血管,未见多形性腺瘤细胞生长。SPA-HK组和SPA组中,裸鼠脂肪细胞均长入组织工程化纤维组织中,可见成片的多形性腺瘤细胞生长,具有典型的多形性腺瘤组织学特征。在多形性腺瘤中,肿瘤性肌上皮细胞成片状增生,并与腺上皮细胞形成双层腺管结构,腺腔内有嗜伊红染色物质,肿瘤中可见黏液样区域。3.6.2.1免疫组织化学染色发现,SPA-XT-II组中未见肿瘤细胞。SPA-HK组和SPA组多形性腺瘤中的肿瘤性肌上皮细胞对抗S-100蛋白,CK8&18,α-SMA均呈阳性表达。结论：1成功构建沉默XT-II基因的腺病毒表达载体。2沉默XT-II基因能成功抑制多形性腺瘤蛋白多糖的生物合成。3阻抑蛋白多糖合成,多形性腺瘤细胞的侵袭性和迁移性降低。4阻抑蛋白多糖合成,多形性腺瘤种植性生长受到阻断。