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背景及目的：幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）属于革兰氏阴性菌，目前世界上有数十亿人感染了H.pylori，它是公认的人类慢性胃炎及消化性溃疡的致病原，与胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤及胃癌密切相关。H.pylori在人群中的感染非常普遍，并且必须依靠抗生素的使用才能将其根除，否则感染将持续终生，但随着抗生素的广泛应用，H.pylori的耐药情况日趋严重，并且出现了同时对三种或三种以上抗生素耐药的多重耐药菌株（multidrug resistant.MDR），如何克服H.pylori的耐药，提高其根除率已成为一世界性难题。近年研究发现细菌外排泵系统在H.pylori耐药尤其多重耐药性中起重要作用，与细菌多重抗生素耐药性有关的主动外排泵系统主要有5个家族，其中的RND类中AcrAB-TolC外排泵是革兰氏阴性细菌产生多重耐药最主要的占优势的外排系统，是许多革兰氏阴性细菌产生耐药尤其是多重耐药的主要机制。为了探讨AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐药中的作用，本文观察了临床分离的H.pylori MDR菌株和对常用的9种抗生素全敏感H.pylori菌株AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因mRNA的表达差异，并观察了了H.pyloriMDR菌株其相对应的抗生素耐药基因的突变，同时研究了几种常见的外排泵抑制剂对H.pylori MDR株耐药性的影响，力图阐明AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐药中的作用。方法：1、H.pylori菌株的选择：在本实验室保存的653株H.pylori临床分离株中筛选出10株对3类/3类以上抗生素耐药的MDR株（耐药组）和10株对9种常用抗生素全敏感株（敏感组）。通过E-test法和K-B纸片扩散法重新确认和验证这20株H.pylori对抗生素的敏感性。2、AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因mRNA的检测：采用q-PCR方法，以gyrB作为参比基因，检测两组细菌AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因hefA、hefB、hefC、hefD、hefE、hefF、hefG、hefH、hefI、HP1489、HP1488mRNA的相对表达量，重复实验3次，并利用SPSS17.0软件将上述基因的表达量与5种H.pylori易产生耐药的抗生素对应的MIC进行线性相关性分析。3、克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑特异性耐药基因的检测：依据目前公认的耐药相关基因对MDR株进行基因检测，克拉霉素检测23S rRNA；甲硝唑检测rdxA和frxA；左氧氟沙星检测gyrA。对耐药菌株相关基因行PCR扩增后进行DNA测序分析。步骤如下：①提取H.pylori基因组DNA；②查GeneBank得23SrRNA、rdxA、frxA、gyrA基因，利用Primer Premier5.0软件设计特异性引物。以上面提取的染色体DNA为模版进行PCR；③DNA测序和生物信息学分析：PCR产物测序，将测序结果利用primer Premier5及AlignX软件等生物信息学软件，以H.pylori标准株J99为参照，进行生物信息学分析。4、外排泵抑制剂对H.pylori MDR株对抗生素敏感影响的分析：分别在Muller-Hinton培养基中加入以下各种不同作用机制的外排泵抑制剂：底物竞争性抑制PaβN（20mg/L），质子动力解偶联剂CCCP(10mg/L)，质子泵抑制剂奥美拉唑（10mg/L）、泮托拉唑（10mg/L）、兰索拉唑（10mg/L）、埃索美拉唑（10mg/L）及雷贝拉唑（10mg/L），然后行药敏试验，观察外排泵抑制剂对H.pylori MDR菌株菌株MIC的影响。以加入泵抑制剂后抗生素MIC下降≥4倍为阳性标准，认为有统计学差异。结果：1、AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因的表达：AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因在所有敏感菌株中均未见高表达，而MDR株中有7株存在部分基因高表达的情况，所有基因的表达量在两组间无明显差异（P>0.05）。具体结果：①hefA mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为0.96±0.71和3.35±9.25，无显著差异（P>0.05），但耐药组中R3菌株表达量高于29，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于3；②hefB mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.13±0.73和4.20±7.22，无显著差异（P>0.05），但耐药组R3及R5菌株表达量均高于10，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于3；③hefC mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.41±0.93和5.73±13.64，无显著差异（P>0.05），但耐药组R3菌株表达量高于44，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于4；④hefD mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为0.86±0.85和3.83±7.30，无显著差异（P>0.05），但耐药组R1、R9菌株表达量均高于15，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于3；⑤hefE mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.56±1.14和9.73±8.79，无显著差异（P>0.05），但耐药组R1、R3及R9菌株表达量均高于16，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于4；⑥hefF mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为0.76±0.68和5.30±9.42，无显著差异（P>0.05），但耐药组R9、R10菌株表达量均高于22，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于4；⑦hefG mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为0.78±0.48和6.61±13.84，无显著差异（P>0.05），但耐药组R3、R8及R10菌株表达量均高于6，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于2；⑧hefH mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.23±0.66和4.38±7.40，无显著差异（P>0.05），但耐药组R4、R10菌株表达量均高于12，敏感组所有菌株和其他MDR株表达量均低于3；⑨hefI mRNA的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.12±0.80和0.85±0.58，无显著差异（P>0.05），所有菌株的表达量均低于3；⑩HP1489的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.31±0.49和1.74±0.64，无显著差异（P>0.05），所有菌株的表达量均低于5； HP1488的相对表达量在敏感组和耐药组分别为1.92±0.61和2.23±0.70，无显著差异（P>0.05），所有菌株的表达量均低于5。2、AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因的表达量与抗生素MIC的关系：AcrAB-TolC外排泵11个相关蛋白编码基因的表达量与5种H.pylori易产生耐药抗生素的MIC均无显著相关性（P>0.05）。3、3种抗生素相关的特异性耐药基因的检测：①8株对克拉霉素耐药的H.pylori MDR株均存在23SrRNA突变，突变形式均为为A2143G；②10株对左氧氟沙星耐药的H.pylori MDR株均存在gyrA突变，突变形式以261位碱基缺失为主，另有几株存在G271A及A272G形式的突变；③10株对甲硝唑耐药的H.pyloriMDR株均存在rdxA和frxA突变，突变点散在分布，每株细菌的突变均影响了其翻译的氨基酸序列。4、外排泵抑制剂对H.pylori MDR株对抗生素敏感性的影响：①加入外排泵抑制剂PAβN后，10株H.pylori MDR株中有4株克拉霉素的MIC出现了4倍或4倍以上的变化；②加入外排泵抑制剂CCCP后，10株MDR株中有4株甲硝唑的MIC出现了4倍或4倍以上的变化，另有2株克拉霉素的MIC出现了4倍或4倍以上的变化；③加入质子泵抑制剂（奥美拉唑、泮托拉唑、兰索拉唑、埃索美拉唑及雷贝拉唑）后，抗生素对MDR株的MIC未发生变化。结论：1、AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因在部分临床分离的H.pylori MDR株中存在高表达，而所有临床分离的H.pylori敏感株中未见高表达，且外排泵抑制剂能降低部分抗生素对H.pylori MDR株的MIC，提示AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐药中起一定作用。2、并不是所有的H.pylori MDR株均存在AcrAB-TolC外排泵相关蛋白编码基因高表达，且后者的表达量与抗生素对H.pylori MDR株的MIC无显著相关性，提示H.pyloriMDR的多重耐药不是完全由AcrAB-TolC外排泵所致。3、所有H.pylori MDR株的耐药情况与耐药基因突变的情况相符合，提示AcrAB-TolC外排泵与特异性耐药突变共同介导了H.pylori MDR的多重耐药。