酶法催化合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的研究

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L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(丙谷二肽)具有溶解度高,水溶性和热稳定性强的优点已逐渐替代谷氨酰胺成为主要的肠外营养用药。化学合成法生产丙谷二肽反应步骤多、副产物多、试剂毒性大且非环境友好。日本的利用来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC 15245中的L-氨基酸连接酶催化生产二肽的专利技术,克服了化学法生产的缺点,但仍存在ATP消耗较大,催化生产效率低等问题。本研究采用大肠杆菌为宿主,通过构建L-氨基酸连接酶、聚磷酸激酶、乙酸激酶等的重组表达载体,形成L-氨基酸连接酶偶联ATP循环再生制备丙谷二肽的酶催化反应体系,通过对底物和酶的配比以及多酶催化反应条件的优化,增加丙谷二肽的得率和转化率,提高反应的经济性和工业可行性。根据Bacillus subtilis ATCC 15245中的L-氨基酸连接酶YwfE的编码基因序列进行密码子优化后合成,克隆后连接至载体pET-His上,转入Escherichia coli BL21(DE)中进行表达。其次利用重组蛋白的His标签,对其进行Ni-NAT亲和纯化。纯化后的YwfE在37℃,pH为9.0时酶活最高,为2752U/mg。在该条件下与30mML-丙氨酸,30 mM L-谷氨酰胺和30 mM ATP反应7 h后最终生成21.8 mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺,转化率为71.6%。利用PCR技术从E.coliMG1655基因组中成功扩增出聚磷酸激酶编码基因ppk1和乙酸激酶编码基因ack1,从Rhodobacter Sphaeroides扩增出聚磷酸激酶编码基因ppk2,从Bulgaricus ATCC 11842和Clostridium a etobutylicum ATCC 824 扩增出乙酸激酶编码基因ack2和ack3,然后分别连接至载体pET-His上,转入Escherichiacoli BL21(DE)中进行表达。利用重组蛋白的His标签,分别进行Ni-NAT亲和纯化,再进行酶学性质的分析。聚磷酸激酶Ppk1和Ppk2在47℃,pH为8.0时酶活最高,分别为237 U/mg,356 U/mg,对底物ADP的转化率分别为15.4%和20.1%。乙酸激酶Ack1,Ack2,Ack3 在 37℃,pH 为 8.0 时酶活最高,分别为 327U/mg,453U/mg,476 U/mg,对底物ADP的转化率分别为24.5%,24.5%,25.1%。将聚磷酸激酶Ppk1,Ppk2作为ATP再生用酶分别与氨基酸连接酶YwfE进行偶联,反应体系为30mM的Ala,30mMGln,5mM的ADP,30mM聚磷酸钠,在温度为37 ℃,pH为9.0的条件下产量最高,转化率为分别为45%、51.3%。将乙酸激酶Ackl,Ack2,Ack3作为ATP再生用酶分别与氨基酸连接酶YwfE进行偶联,反应体系为30mMAla,30mMGln,5mM的ADP,30mM乙酰磷酸,在温度为37℃,pH为9.0的条件下产量最高,转化率分别为64.3%、68.4%、71.1%。其中乙酸激酶Ack3作为ATP再生用酶与氨基酸连接酶YwfE偶联效果最好,与直接添加ATP效果相当。
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