热休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白CHIP(The carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein,CHIP)也被称为STUB1(STIP1 homology and U-Box containing protein 1),它是一个E3泛素化连接酶,在不同的肿瘤中发挥完全不同的作用,既可发挥癌基因作用,也可发挥抑癌基因样作用。目前为止,CHIP在结直肠癌中的功能及作用机制仍不清楚。本研究中,我们通过构建稳定敲除或高表达CHIP的结直肠癌细胞株,观察CHIP对结直肠癌细胞生长、增殖、迁移和侵袭等的影响,并探讨其潜在的作用机制。结果表明,在结直肠癌细胞中敲除CHIP,抑制了细胞的生长和增殖,促进G0-G1期阻滞,同时抑制了细胞的体内、体外的迁移和侵袭能力。CHIP低表达后,结直肠癌细胞ERK、AKT信号通路活性降低,细胞周期相关蛋白cyclin D1下调,p27上调,同时上皮细胞表面标志E-cadherin表达上调。尽管CHIP高表达对结直肠癌细胞的生长,增殖和细胞周期,凋亡无明显影响,CHIP高表达显著促进了结直肠癌细胞体内、体外的迁移和侵袭能力。CHIP高表达后,结直肠癌细胞的ERK、AKT信号通路活性增强,细胞周期相关蛋白cyclin D1和p27表达无明显变化,但是上皮细胞表面标志E-cadherin表达下调。CHIP敲除引起AKT信号通路活性降低,GSK-3β活性增强,Slug表达下调,E-cadherin上调,而CHIP高表达引起AKT信号通路活化,GSK-3β活性降低,Slug表达上调,E-cadherin下调。液相蛋白质谱分析显示E-cadherin在过表达CHIP的DLD-1细胞株中较对照组下调,Disease富集分析显示E-cadherin与结直肠癌发病机制相关,GO和KEGG信号通路富集分析显示E-cadherin与细胞与细胞粘附,细胞细胞连接相关,这些都与EMT发生,结直肠癌迁移和侵袭机制相关。另外,结直肠癌组织芯片分析结果显示CHIP在癌组织中的表达显著高于癌旁组织,E-cadherin在癌组织的表达低于癌旁组织。CHIP和E-cadherin的表达成负相关。CHIP与肿瘤浸润深度,淋巴结转移,TNM分期成正相关,CHIP表达水平高的患者总的生存期短。E-cadherin与肿瘤浸润深度,淋巴结转移,TNM分期成负相关,E-caherin表达水平高的患者总的生存期长。综上所述,CHIP在结直肠癌中发挥癌基因样作用,是结直肠癌中提示预后不良的独立预后指标之一。第一部分E3泛素化连接酶CHIP对结直肠癌细胞生物学行为的影响目的:阐明E3泛素化连接酶CHIP对结直肠癌细胞生长、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响。方法:1,q RT-PCR及Western blotting法检测CHIP在结直肠癌细胞株DLD-1,HT-29,COLO320DM以及Ca CO2中的m RNA和蛋白水平的表达。2,设计CHIP基因的RNA干扰片段,选取质粒p Silencer3.1-H1-neo为载体,构建p Silencer3.1-si CHIP低表达质粒,同时构建MSCV-GFP-h CHIP高表达质粒,再利用Lipofectmine 2000,将p Silencer3.1-si CHIP及空白对照p Silencer3.1-H1-neo质粒,MSCV-GFP-h CHIP及空白对照MSCV-GFP质粒,转染结直肠癌DLD-1和HT-29细胞,构建稳定敲除和高表达CHIP的结直肠癌细胞株。3,以稳定敲除或高表达CHIP的结直肠癌细胞为研究对象,利用x-Celligence系统分析CHIP对结直肠癌细胞生长的影响,利用CCK-8、Brdu增殖实验分析CHIP对结直肠癌细胞增殖的影响,利用流式细胞术分析CHIP对结直肠癌细胞凋亡及细胞周期的作用。4,体外,利用x-Celligence系统、划痕实验和Transwell实验分析CHIP对结直肠癌各转染细胞迁移和侵袭能力的影响;体内利用裸鼠腹腔注射种植转移模型,研究CHIP对裸鼠体内腹腔种植转移能力的影响,并通过Western blotting和IHC法验证CHIP在各转移瘤中的表达情况。结果:1,CHIP m RNA和蛋白在结直肠癌细胞株中的表达水平存在差异性。CHIP m RNA在DLD-1和COLO320DM中呈现高表达,在HT-29以及Ca CO2中表达水平相对较低。CHIP蛋白水平在HT-29和DLD-1中呈现高表达,而在野生型细胞株COLO320DM和Ca CO2中表达水平较低。2,经测序鉴定,成功构建了CHIP低表达质粒p Silencer3.1-si CHIP和高表达质粒MSCV-GFP-h CHIP。3,成功建立稳定敲除和高表达CHIP的结直肠癌细胞株。q RT-PCR及Western blotting实验鉴定结果显示,与DLD-1-sictrl相比,DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9细胞株的CHIP的m RNA和蛋白表达水平显著降低。相反,CHIP m RNA和蛋白水平在DLD-1-h CHIP-1和DLD-1-h CHIP-3以及HT-29-h CHIP-3和HT-29-h CHIP-5细胞中的表达明显高于相应的对照组。4,x-Celligence系统实时监测细胞生长72 h结果显示:DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9细胞生长速度明显慢于DLD-1-sictrl。DLD-1-h CHIP-1、DLD-1-h CHIP-3细胞与DLD-1-ctrl细胞生长速度无明显区别,HT-29-h CHIP-3、HT-29-h CHIP-5细胞与HT-29-ctrl细胞生长速度也无明显区别。5,CCK-8和Brdu细胞增殖实验显示,DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9细胞株的增殖活性明显低于对照组,DLD-1-h CHIP-1、DLD-1-h CHIP-3细胞与DLD-1-ctrl细胞增殖活性无明显区别;同样地,HT-29-h CHIP-3、HT-29-h CHIP-5细胞与HT-29-ctrl细胞增殖活性也无明显区别。6,流式细胞术分别检测敲除或高表达CHIP对DLD-1细胞24、48和72 h的细胞凋亡结果显示:DLD-1-si CHIP-3、DLD-1-si CHIP-9细胞株和DLD-1-sictrl,DLD-1-h CHIP-1、DLD-1-h CHIP-3和DLD-1-ctrl细胞的细胞凋亡无明显变化。细胞周期检测结果显示:与DLD-1-sictrl相比,DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9细胞周期G0-G1期阻滞。DLD-1-h CHIP-1、DLD-1-h CHIP-3和DLD-1-ctrl细胞的各细胞周期比例无明显差异。7,x-Celligence系统实时动态监测细胞迁移情况显示,DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9细胞的迁移能力显著低于DLD-1-sictrl细胞。相反,DLD-1-h CHIP-1和DLD-1-h CHIP-3细胞迁移能力明显强于对照组。相一致地,Transwell实验结果显示DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9细胞迁移和侵袭能力显著低于DLD-1-sictrl细胞,DLD-1-h CHIP-1和DLD-1-h CHIP-3细胞迁移和侵袭能力显著高于DLD-1-ctrl细胞。划痕实验结果显示DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9的迁移能力显著低于DLD-1-sictrl细胞;相反,DLD-1-h CHIP-1和DLD-1-h CHIP-3的迁移能力显著高于DLD-1-ctrl组细胞。Transwell实验结果显示HT-29-h CHIP-3、HT-29-h CHIP-5与HT-29-ctrl细胞24 h内细胞的迁移和侵袭能力均高于对照组。小鼠腹腔注射种植转移模型显示DLD-1-si CHIP-3组小鼠肠系膜转移灶个数显著少于DLD-1-sictrl细胞组,相反,DLD-1-h CHIP-1组小鼠肠系膜转移灶个数显著多于DLD-1-ctrl细胞组。免疫组化和Western blotting结果显示:DLD-1-si CHIP-3组转移瘤组织CHIP表达几乎无表达,DLD-1-h CHIP-1组转移瘤组织显著高于DLD-1-ctrl组。结论:敲除CHIP抑制了CRC细胞的生长,细胞增殖降低,细胞周期G0-G1期阻滞;高表达CHIP对CRC细胞的生长,增殖和凋亡和细胞周期无显著地影响。敲除CHIP抑制了体内、外结直肠癌细胞的迁移和侵袭转移能力,高表达CHIP促进了体内外结直肠癌细胞的迁移和侵袭转移能力。第二部分E3泛素化连接酶CHIP对结直肠癌细胞生物学行为影响的机制分析目的:分析CHIP过表达对结直肠癌细胞株DLD-1蛋白表达谱的影响,阐明E3泛素化连接酶CHIP对结直肠癌细胞生物学行为影响的作用机制。方法:1,以稳定高表达CHIP的结直肠癌细胞株DLD-1-h CHIP-3和对照DLD-1-ctrl细胞株为研究对象,提取全蛋白,并进行BCA定量和SDS-PAGE检测,使用i TRAQ标记全蛋白,并进行C18色谱柱样品分级,最后将样品充分溶解后上样至液质联用仪。选择低于1%FDR条件下高度可信的多肽作为蛋白质定性鉴定的过滤参数,选择特异性多肽用于不同样品间蛋白质的相对定量分析。统计分析结果,筛选差异蛋白,进行差异蛋白聚类分析,以及基于人物种功能数据库进行GO、Pathway功能注释和富集等高级分析,差异蛋白相互作用分析等。2,采用Western blotting实验分析CHIP敲除或过表达后对DLD-1细胞ERK、AKT、NF-кB信号通路、细胞周期相关蛋白以及Integrinβ1、u PA和u PAR等表达的影响。3,以稳定敲除或高表达CHIP的结直肠癌细胞DLD-1细胞为研究对象,利用IHC法分析敲除或过表达CHIP的DLD-1细胞E-cadherin、Ep CAM和CK8/18的表达,利用q RT-PCR和Western blotting法分析CHIP对结直肠癌细胞EMT相关细胞表面标志m RNA和蛋白水平的影响,进一步用Western blotting法分析CHIP敲除或过表达后DLD-1细胞AKT信号通路相关GSK-3β和p-GSK-3β以及Slug的表达水平。结果:1,液相蛋白质谱分析结果显示,与DLD-1-ctrl组相比,在DLD-1-h CHIP-3组中共检测到789种差异蛋白,其中包含414种蛋白上调,375种蛋白下调。E-cadherin为下调蛋白之一。GO分析DLD-1-ctrl与DLD-1-h CHIP-3中789个差异蛋白在细胞成分分布方面发现,差异蛋白主要定位于细胞膜固有组分、细胞膜有机组分、细胞工程、细胞外间隙等。生物过程分析表明,DLD-1-ctrl与DLD-1-h CHIP-3中差异蛋白主要参与细胞通讯的调节,信号转导、分子功能调节及细胞或细胞组分运动等。根据分子功能注释,差异蛋白主要发挥分子功能调节、核糖体结构组分、受体活性及酶抑制剂活性等功能。789个差异蛋白做KEGG信号通路分析,共获得28个通路(P≤0.05),为代谢性谷氨酸受体组III途径,尼古丁药效动力学途径,一般转录途径,谷氨酸能突触以及细胞粘附等。Disease富集分析显示,789个差异蛋白依次参与少年特发性关节炎对甲氨蝶呤的反应,Tourette的综合症或强迫症,慢性髓细胞白血病,克罗恩病等疾病。GO分析显示差异蛋白E-cadherin参与细胞与细胞之间粘附及胞浆-胞膜粘附等生物过程,KEGG分析显示E-cadherin参与细胞胞外基质组织,细胞-细胞连接组织,整合素细胞表面相互作用等通路,另外,差异蛋白E-cadherin还参与结直肠癌的发生和发展。2,Western blotting结果显示DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9细胞的AKT磷酸化水平以及ERK1/2的磷酸化水平明显较DLD-1-sictrl细胞低;相反,DLD-1-h CHIP-1和DLD-1-h CHIP-3细胞的AKT磷酸化水平以及ERK1/2的磷酸化水平明显较DLD-1-ctrl细胞高。有趣的是,NF-кB活性在低表达或高表达CHIP的结直肠癌细胞中无显著变化。另外,与对照组相比,DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9细胞中细胞周期蛋白cyclin D1显著下调,p27蛋白上调,而DLD-1-h CHIP-1、DLD-1-h CHIP-3和DLD-1-ctrl细胞中cyclin D1和p27表达无显著差异。Western blotting分析显示DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9组的Integrinβ1和u PAR水平低于DLD-1-sictrl组,而DLD-1-h CHIP-1和DLD-1-h CHIP-3组中Integrinβ1和u PAR表达水平显著高于DLD-1-ctrl组。3,IHC法分析DLD-1转染细胞中CHIP、E-cadherin、Ep CAM和CK8/18的表达发现,CHIP主要分布于结直肠癌细胞胞膜和胞浆中,DLD-1-si CHIP-3组CHIP的表达低于对照组,而DLD-1-h CHIP-1细胞中CHIP的表达高于对照组。上皮表面标志E-cadherin、Ep CAM和CK8/18主要分布于细胞胞膜和胞浆,DLD-1-si CHIP-3组E-cadherin的表达高于对照组,而DLD-1-h CHIP-1细胞中的E-cadherin表达低于对照组。Ep CAM和CK8/18在各组细胞中的表达无显著差异。4,q RT-PCR和Western blotting结果显示DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9的E-cadherin在m RNA和蛋白水平上均高于DLD-1-sictrl组,而DLD-1-h CHIP-1和DLD-1-h CHIP-3的E-cadherin在m RNA和蛋白水平上显著低于DLD-1-ctrl组,而Ep CAM和CK8/18的m RNA和蛋白表达在各组细胞株DLD-1-si CHIP-3、DLD-1-si CHIP-9与DLD-1-sictrl细胞,DLD-1-h CHIP-1、DLD-1-h CHIP-3与DLD-1-ctrl中无显著差异。Western blotting进一步分析显示DLD-1-si CHIP-3和DLD-1-si CHIP-9中的p-GSK-3β水平低于DLD-1-sictrl,同时Slug的表达低DLD-1-sictrl组,相反,p-GSK-3β和Slug的蛋白水平在DLD-1-h CHIP-1和DLD-1-h CHIP-3中的表达水平显著高于DLD-1-ctrl组。结论:敲除CHIP抑制了结直肠癌细胞中AKT和ERK信号通路的活性,细胞周期蛋白cyclin D1降低,p27蛋白上调;但高表达CHIP使得结直肠癌细胞中AKT,ERK信号通路活性增强,cyclin D1和p27表达水平无明显变化。敲除CHIP增强DLD-1细胞中E-cadherin的表达,而高表达CHIP后,E-cadherin的表达明显下降。高表达CHIP可能通过增强AKT信号通路活性抑制GSK-3β活性,从而通过增强Slug的表达来抑制E-cadherin蛋白水平,从而促进EMT迁移和侵袭的发生。第三部分CHIP和E-cadherin在结直肠癌组织中的表达谱及临床意义目的:探讨CHIP和E-cadherin在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达谱及与结直肠癌临床各指标及预后的相关性。方法:以国家人类遗传资源共享服务平台(平台编号:2005DKA21300),上海芯超生物科技有限公司提供的结直肠癌组织和癌旁组织芯片标本为研究对象,采用IHC法检测CHIP和E-cadherin在结直肠癌和癌旁组织中的表达情况,结合临床病理和随访资料,采用卡方检验分析CHIP和E-cadherin与临床各指标之间的关系,采用Spearman’s法分析CHIP与E-cadherin表达的相关性,采用Kaplan-Meier分析CHIP和E-cadherin与预后的关系,采用Cox单因素和多因素回归分析结直肠癌中的独立预后指标。结果:在93例结直肠癌组织中,有67例存在CHIP高表达(72.04%),对应的87例癌旁组织中共有37例存在CHIP高表达(42.53%)。卡方检验结果显示CHIP在癌组织的表达较癌旁组织高(P<0.001)。93例结直肠癌组织中,有57例存在E-cadherin低表达(61.29%),对应的87例癌旁组织中共有22例存在E-cadherin低表达(25.29%)。卡方检验结果显示E-cadherin在癌组织的表达较癌旁组织低(P<0.001)。Spearman’s法结果,显示CHIP与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.243,P=0.019)。CHIP表达与肿瘤浸润深度(P=0.039),淋巴结转移(P=0.003),以及TNM分期(P=0.003)呈正相关,E-cadherin的表达与肿瘤浸润深度(P=0.048),淋巴结转移(P=0.043),以及TNM分期(P=0.020)呈负相关。Kaplan-Meier生存分析结果显示CHIP高表达提示总的生存期比低表达者短(P=0.001),E-cadherin高表达提示总的生存期比低表达者长(P=0.010)。单因素生存分析显示肿瘤分化程度,淋巴结转移,TNM分期,CHIP和E-cadherin表达与生存期相关(P<0.01)。多因素生存分析显示肿瘤分化程度(HR=3.030,95%CI 1.485-6.180,P=0.002)和CHIP表达水平(HR=7.163,95%CI2.188-23.453,P=0.001)与生存期相关。结论:CHIP在癌组织的表达较癌旁组织高,E-cadherin在癌组织的表达较癌旁组织低。结直肠癌组织中CHIP与E-cadherin表达呈负相关。CHIP表达水平是结直肠癌独立预后指标之一。