研究目的： 细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程，以细胞核浓缩、染色体DNA被以核小体为单位切成梯状片段(ladder)、细胞缩小，最终形成凋亡小体等形态变化为特征。细胞凋亡除了在维护机体内环境稳定方面发挥着极为重要的作用以外，大量证据表明血管平滑肌细胞凋亡在动脉粥样硬化、冠脉狭窄、高血压等疾病的病理过程中扮演着十分重要的角色。细胞凋亡的细胞内信息传导途径可大致分为二个阶段，即诱导阶段和执行阶段。在细胞凋亡的诱导阶段诱导细胞凋亡的因素可分为内源性和外源性因素。内源性因素包括细胞凋亡诱发机制(如Fas配体、肿瘤坏死因子等)的激活和细胞凋亡抑制机制(生长因子、激素、受体因子等增殖性因子)的失活。外源性因素包括放射线、热休克等物理性因素，药物、毒物等化学性因素以及病毒等生物学因素。近年来还发现，活性氧簇(ROS)诱导的凋亡不同程度地参与了神经系统疾病、心血管疾病、免疫性疾病及老化等疾病的发生发展过程。 ROS主要包括H2O2、单态氧、O2·和·OH等，其中H2O2发挥了非常重要的作用，因为H2O2能通过多种氧化应激状态产生并且能够自由地在细胞及组织之间弥散。在生理情况下，由于H2O2可以被过氧化氢酶分解为H2O，所以机体内H2O2浓度不会过高；但在一些病理情况如高血压、动脉粥样硬化以及脑卒中等，这些酶被大量消耗，H2O2的浓度可升高到毫摩尔水平，大量研究发现，即使在H2O2浓度远低于此水平的几十至几百微摩尔时就可引起血管平滑肌细胞凋亡。最近的研究表明，平滑肌细胞凋亡参与了动脉粥样硬化、高血压、脑卒中等心脑血管疾病引起的血管重构过程。H2O2诱导细胞凋亡的作用机制如下：H2O2可导致细胞Ca2+内流增加，从而导致内源性氧自由基水平升高，后者作为细胞内信使，进一步激活转录因子核因子κB(NF—κB)，来调控基因转录，进而使促凋亡基因p53，Bad，CED23等表达上调，改变细胞周期，从而诱导细胞发生凋亡。 三七皂甙Rd是从三七总皂甙中提取一种单体成分，分子量为1001.2，分子式为C48H82O18·3H2O，本课题组研究发现，在血管平滑肌细胞上Rd是ROCC和SOCC特异性的阻断剂，而对VDCC和钙释放没有作用，可以改善高血压大鼠脑基底动脉的重构和保护牛主动脉内皮细胞的凋亡。有研究发现三七皂甙Rd可减弱加速衰老小鼠模型的氧化应激损伤，并且有保护频繁放射导致细胞凋亡的作用，其作用机制可能通过降低Bax/Bcl—2、Bax/Bcl—xL、cytochrome C的释放和caspase—3的活化切割等。三七皂甙Rd对氧化应激介导的脑基底动脉平滑肌细胞凋亡的作用鲜有报道。Rd为ROCC和SOCC特异性的阻断剂，推测其可能通过减弱细胞Ca2+内流而保护H2O2诱导细胞凋亡。 基于上述，本研究拟在H2O2诱导大鼠脑基底动脉平滑肌细胞凋亡模型上，通过形态学、流式细胞术和线粒体膜电位检测等方面观察三七皂甙Rd对H2O2诱导大鼠脑基底动脉平滑肌细胞凋亡的保护作用。 研究方法： 1、根据本实验室成熟建立的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞分离培养方法进行大鼠脑基底动脉平滑肌细胞的原代培养和传代。通过形态学观察和α—actin免疫荧光法鉴定平滑肌细胞。 2、应用Hoechst33258核染色法、DNA琼脂糖凝胶电泳以及流式细胞术观察H2O2处理后的细胞核形态、DNA断裂的变化情况，建立H2O2诱导大鼠脑基底动脉平滑肌细胞凋亡模型。 3、使用CCK—8法检测H2O2对大鼠脑基底动脉平滑肌细胞活性的影响以及三七皂甙Rd的保护作用。 4、通过Hoechst33258染色法和流式细胞术检测三七皂甙Rd对H2O2诱导大鼠脑基底动脉平滑肌细胞凋亡的影响。 5、使用JC-1染料，在激光共聚焦扫描显微镜上检测三七皂甙Rd对H2O2诱导大鼠脑基底动脉平滑肌细胞线粒体膜电位改变的影响。 研究结果： 1、原代培养的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞在相差显微镜下观察，呈梭形，高低起伏排列呈“峰，谷”状，α—actin阳性率大于95％，满足研究要求。 2、100～400μM H2O2处理细胞24h后，Hoechst33258核染色显示，与对照组相比，H2O2处理组细胞出现明显的核固缩和凋亡小体，且随H2O2浓度增加，发生凋亡的细胞数目明显增加。 3、100～400μM H2O2处理细胞24h后，提取细胞DNA，琼脂糖凝胶电泳发现，DNA断裂呈现“梯状”图谱，且DNA断裂情况随H2O2浓度增加而加重。 4、H2O2(200μM)作用24h后，CCK—8检测发现大鼠脑基底动脉平滑肌细胞活性降低为对照组的48.9±8.5％，而预孵三七皂甙Rd(2.5，5，10，20，40μM)30min后，细胞活性分别为对照组的50.2±8.7％、52.9±8.1％、60.0±6.8％、71.5±4.0％、87.2±4.7％、89.5±5.8％，呈浓度依赖性，并且在Rd浓度为10μM以上时，Rd对H2O2(200μM)引起的细胞活性降低的抑制作用有统计学差别(P<0.05，One—Way ANOVA)，在Rd浓度为40μM时，该抑制作用达到最大效应。三七皂甙Rd抑制作用的1C50为18.8μM。而等量溶媒对照组无明显影响。 5、Hoechst33258染色后发现H2O2(200μM)作用24h后，与对照组相比，大鼠脑基底动脉平滑肌细胞出现核固缩和凋亡小体数目显著增加，三七皂甙Rd(10，20，40μM)预孵30min后，可浓度依赖地减少核固缩和凋亡小体的形成。等量溶媒对H2O2诱导核固缩和凋亡小体无明显影响。流式细胞术结果提示H2O2(200μM)作用24h后，大鼠脑基底动脉平滑肌细胞凋亡率约为26.1％。而三七皂甙Rd(20μM)预孵处理后，凋亡率减少约为13.8％。 6、H2O2处理细胞6h后线粒体膜电位Δψm显著下降，而三七皂甙Rd(20μM)预孵30min后再进行处理，可以减轻细胞线粒体损伤。 结论： H2O2可以引起大鼠脑基底动脉平滑肌细胞活性降低、凋亡率增加和线粒体膜电位下降，而这些改变可被三七皂甙Rd呈浓度依赖性抑制，研究还提示线粒体途径介导的细胞凋亡参与了H2O2诱导的细胞凋亡过程，并且本研究证实三七皂甙Rd可能通过作用于该途径进而保护细胞凋亡。