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甲状腺激素(thyroid hormone,TH)在牙鲆变态过程中发挥着极其关键的调控作用,它通过甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors,TRs)直接控制着仔鱼能否成功变态及其变态进程。研究表明,TR与维甲酸X受体(retinoid X receptors)或其他核受体形成异二聚体结合到靶基因启动子区域的甲状腺激素应答元件上(thyroid hormone response elements,TREs),从而调控靶基因转录。为了鉴定出TH-TRs信号通路上直接调控的靶基因,本研究以甲状腺激素受体TRαA为对象,通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和重组报告基因表达载体(含候选靶基因5’-侧翼序列的缺失片段)的双荧光素酶报告实验的研究,鉴定出atoh8和Syt-1-like为牙鲆TRs介导甲状腺激素直接调控的靶基因。主要结果如下:1.牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素TH调控的候选靶基因的筛选本实验基于转录组和TREs数据库筛选,结合TREs识别类型,初步确定atoh8(Gene ID:109627718)和Syt-1-like(Gene ID:109624206)为牙鲆TRs介导TH调控的候选靶基因。启动子转录活性及转录因子结合位点预测分析显示,atoh8基因5’-侧翼序列预测有3个TREs位点,其中还包含GATA-1、E2F、GR、GAGA、MyoD、Cart-1、E2F4、RARβ、RARα、Pax-4a等转录因子结合位点;根据TREs所在位置分别设计了3个上游引物Pro-atoh8-F1/F2/F3和1个共同的下游引物Pro-atoh8-R,PCR扩增可依次得到包含3个、2个、1个TREs位点的缺失片段。Syt-1-like则预测有2个TREs位点,其中还有ZEB、HIP-1、AP-1 GRα、TBP等转录因子结合位点;根据TREs所在位置分别设计了3个上游引物Pro-Syt-1-like-F1/F2/F3和1个共同的下游引物Pro-Syt-1-like-R,PCR扩增可依次得到包含2个、1个、0个TREs位点的缺失片段。本实验中,通过PCR扩增,对atoh8基因5’-侧翼序列而言,实际得到大小分别为1517bp、1333bp、708bp的缺失片段;对Syt-1-like基因5’-侧翼序列而言,实际得到大小分别为1692、1079bp、791bp的缺失片段;成功构建了重组质粒pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708和pGL3-Pro-Syt1-like-1692/1079/791,用于细胞转染。2.牙鲆TRαA真核表达载体构建及融合蛋白表达纯化本实验采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区,并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒瞬时转染HEK293T细胞后,RT-PCR、实时定量PCR与Western Blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA。在目的蛋白N端融合Flag纯化标签,由于3×Flag标签分子量相对较小,因此不影响蛋白质的活性,纯化产物可直接用于蛋白功能的研究。本实验首次采用哺乳动物细胞蛋白表达系统成功表达并纯化了3×Flag-TRαA融合蛋白,为结构分析和功能研究奠定了物质基础。3.TRαA与候选靶基因5’-侧翼序列相互作用分析为了检测TRαA与候选靶基因(atoh8和Syt-1-like)5’-侧翼序列是否有相互作用,即验证候选靶基因是否为TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因,本实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和重组报告基因表达载体的双荧光素酶报告实验,探究不同的5’-侧翼序列长度和对同一5’-侧翼序列进行不同处理,对萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶比值的变化,即检测其对启动子转录活性的影响。对atoh8基因设计了3组实验:(1)不同长度(1517bp、1333bp、708bp)的5’-侧翼序列对atoh8基因启动子活性的影响;(2)对Pro-atoh8-1517的不同处理(TRαA、TRαA+T3)对启动子活性的影响;(3)对Pro-atoh8-1333的不同处理(TRαA、TRαA+T3)对启动子活性的影响;(4)对Pro-atoh8-708的不同处理(TRαA、TRαA+T3)对启动子活性的影响。结果表明:pGL3-Pro-atoh8-1517包含2个TRE位点,且TRαA受体通过DNA结合结构域(DBD)结合在atoh8基因5’调控区-1497~-688特异的TRE序列来调节该基因的转录,由此证明atoh8是TRαA介导TH调控的直接靶基因。对Syt-1-like基因设计了4组实验:(1)不同长度(1692bp、1079bp、791bp)的5’-侧翼序列对Syt-1-like基因启动子活性的影响;(2)对Pro-Syt-1-like-1692的不同处理(TRαA、TRαA+T3)对启动子活性的影响;(3)对Pro-Syt-1-like-1079的不同处理(TRαA、TRαA+T3)对启动子活性的影响;(4)对Pro-Syt-1-like-791的不同处理(TRαA、TRαA+T3)对启动子活性的影响。结果表明:pGL3-Pro-Syt1-like-1692至少包含2个TRE位点,且TRαA受体通过DNA结合结构域(DBD)结合在Syt-1-like基因5’调控区-1520~-1特异的TRE序列来调节该基因的转录,由此证明Syt-1-like是TRαA介导TH调控的直接靶基因。4.候选靶基因在牙鲆仔鱼变态时期的表达为了验证候选靶基因(atoh8,Syt-1-like)对TH的应答情况,采用实时定量PCR技术检测了atoh8和Syt-1-like在仔鱼变态过程中NC、TH和TU组的表达变化,结果显示:在变态早期(21dph)阶段,atoh8基因在TH组中的表达水平较之相应NC组升高,但并不显著,而在变态高峰期(28dph)时TU处理组较之相应NC组显著降低,这提示atoh8对T3存在弱的应答效应;而Syt-1-like基因在变态早期(21dph)阶段,其在TH组中的表达水平较之对应NC组显著升高,且对应TU组中的表达水平下降,但并不显著,这充分说明Syt-1-like基因在仔鱼变态早期显著受TH调控,暗示Syt-1-like是由甲状腺激素受体介导的TH调控的靶基因。综合以上结果,有理由推断atoh8和Syt-1-like都是甲状腺激素受体介导甲状腺激素调控的靶基因,在特定的发育时期(变态早期),前者是一种低水平的弱的调控作用,后者是一种高水平的强的调控作用,二者对甲状腺激素应答的差异性可能跟基因功能有关。结论:TRαA受体结合在atoh8基因启动子区-1497~-688特异的TRE序列和Syt-1-like基因启动子区-1520~-1特异的TRE序列,分别来调节这些基因的转录,故atoh8和Syt-1-like是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。本研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。