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生殖功能受脑部神经内分泌神经元的集中控制。促性腺激素释放激素(GnRH)系统作为这些调控通路的中心环节，下丘脑GnRH神经元适时激活及协调表达决定着个体性别发育和生殖功能的发挥。GnRH神经元受到一系列调控因子的作用，这些因子既有发挥激活功能的Kisspeptins、谷氨酸等，也包括抑制作用的多巴胺（dopamine）、γ-氨基丁酸(GABA)等。本研究中，我们采用斑马鱼为材料，通过转基因的方法制备了绿色荧光蛋白标记GnRH3神经元的T g(gnrh3: EGFP)转基因斑马鱼。以此为基础，研究Kisspeptin神经元、GABAergic神经元与GnRH3神经元的相互关系。另外，我们还发现GnRH神经细胞内γ-谷氨酰环化转移酶(GGCT)的表达影响着gnrh基因的表达。 Kisspeptin作为一种神经内分泌激素在激活GnRH神经元方面扮演重要角色，并决定着哺乳动物青春期启动过程。尽管如此，Kisspeptin神经元在非哺乳脊椎动物中的功能尚不清楚。本研究中，我们采用转基因的方法对斑马鱼Kiss1、Kiss2神经元进行荧光蛋白（mCherry）特异标记，制备获得Tg(kiss1: mCherry)和Tg(kiss2:mCherry)转基因斑马鱼。观察Tg(kiss1: mCherry)斑马鱼脑部荧光蛋白标记的神经元发现，Kiss1神经元细胞集中分布在松果体缰的中间核与腹侧核。腹侧核底部散发出的Kiss1神经纤维组成后屈束，向后投射到脚间核的腹侧和中缝核。观察Tg（kiss: mC herry）斑马鱼荧光标记神经元发现，Kiss2神经细胞主要分布在下丘脑周室核背侧区域，少量分布在后结节周室核和视前区。Kiss2神经纤维投射到端脑、视顶盖、中脑、下丘脑和垂体中，形成一个广泛分布的神经网络。为了探究Kisspeptin神经元与GnRH3神经元的关系，Tg(kiss1:mCherry)、Tg(kiss: mCherry)斑马鱼分别与Tg(gnrh3: EGFP)斑马鱼杂交获得Tg（kiss mCherry/gnrh3: EG FP）、Tg（kiss: mCherry/gnrh3: EG FP）双重转基因斑马鱼。双重斑马鱼体内观察发现，视交叉处GnRH3神经纤维向上投射到松果体缰的外侧并围绕着缰核分布。松果体缰腹下端邻近Kiss1神经束的GnRH3纤维数目明显增加，两种神经纤维联系紧密，少量的GnRH3神经纤维甚至与Kiss1神经纤维直接接触。端脑、视前区和下丘脑内GnRH3神经纤维与Kiss2神经纤维位置邻近，联系紧密，但两者在这些区域内并没有观察到直接接触。下丘脑腹侧的GnRH3、Kiss2神经纤维经垂体柄投射到垂体。垂体内，远端区域的GnRH3神经纤维与Kiss2神经纤维直接接触。这些结果表明斑马鱼脑部Kiss1神经元、Kiss2神经元分布位置不同，两者与GnRH3神经元的联系各异，提示Kiss1和Kiss2在调控斑马鱼生殖功能方面存在各自不同的作用机制。 γ-谷氨酰循环是细胞内合成、分解谷胱甘肽的一条重要代谢通路。γ-谷氨酰环化转移酶作为参与γ-谷氨酰循环的一类催化酶对细胞的正常生命活动具有重要作用。最近的研究表明γ-谷氨酰环化转移酶与肿瘤发生、神经退化性疾病都存在关联，然而相关的生物学机制还不清楚。本实验室前期研究发现转反义sGnRH基因鲤鱼体内抑制sGnRH的表达导致下丘脑内γ-谷氨酰环化转移酶(GGCT)基因表达量上调，研究结果提示鱼类中GGCT可能负向调控sGnRH基因的表达。本研究中，我们以斑马鱼为材料，探索GGCT在生殖内分泌神经元中的功能。斑马鱼基因组存在ggcta和ggctb基因，ggctb编码γ-谷氨酰环化转移酶。早期胚胎表达模式分析发现ggctb基因为合子激活型基因，受精后12小时开始表达。成熟斑马鱼各组织器官内都检测到ggctb mRNA的表达，尤其脑部的表达量最丰富。原位杂交结果显示，发育3天的斑马鱼胚胎ggctb mRNA信号集中在中脑、后脑以及眼睛，发育5天的幼鱼ggctb mRNA信号存在于脑部各个区域。斑马鱼胚胎内注射ggctb短链吗啉代（morpholino oligo）抑制ggctb基因表达导致脑部畸形，中脑和后脑结合处发育异常。另外，我们发现γ-谷氨酰环化转移酶影响gnrh基因的表达。斑马鱼胚胎内抑制ggctb基因的表达，gnrh3基因表达量明显升高。本研究中，我们采用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术靶向敲除斑马鱼ggctb基因，采用转基因技术制备过表达ggctb的转基因斑马鱼。敲除ggctb基因的斑马鱼胚胎时期gnrh3基因表达量显著升高，而青春期阶段脑部gnrh3基因表达量下降。过表达ggctb的斑马鱼体内，胚胎时期gnrh3基因表达量升高，而青春期启动时期gnrh3表达量下降。我们发现γ-谷氨酰环化转移酶影响斑马鱼的生长。相同养殖条件下ggctb基因突变的斑马鱼的平均体重和体长显著低于对照鱼，过表达ggctb斑马鱼的平均体重和体长高于对照鱼。小鼠垂体瘤细胞GT1-1中的实验表明哺乳动物细胞内ggct基因表达与gnrh基因表达同样存在相关性。GT1-1细胞转染过表达ggct的质粒，gnrh1基因表达量显著下调。采用Adox(Adenosine-2，3-dialdehyde)处理GT1-1细胞抑制gnrh1基因的表达，ggct基因表达量相应上调。采用Kisspeptin-10十肽处理GT1-1细胞促进gnrh1基因的表达，ggct基因表达量下调。上述实验结果表明无论哺乳脊椎动物还是非哺乳脊椎动物γ-谷氨酰环化转移酶对gnrh基因的表达都有调节作用。尽管如此，γ-谷氨酰环化转移酶调节gnrh基因表达的生物学机制还有待进一步研究。