冠脉微循环障碍(Coronary Microvascular Dysfunction,CMD)是引起微血管性心绞痛、PCI术后无复流现象以及肥厚性心肌病等心脏疾病的共同原因,成为了当下心血管病防治研究的热点问题之一[1,2]。在CMD的进程中,炎症细胞浸润,促炎因子增多导致血管内皮细胞受损,进而血管功能和冠脉血流储备降低,影响心肌收缩功能[3,4];其中,巨噬细胞(macrophage,M)表型M1/M2极化在此进程中发挥重要作用[5-7],同时miR-155在M1/M2极化时具有举足轻重的作用[8]。而中医药对CMD心肌组织中巨噬细胞极化的影响,尚无报道。补肾活血方[9-12]不仅具有较好的治疗绝经后CMD的效果,而且可防治去卵巢大鼠冠脉微血管内皮细胞形态和功能损伤及炎症反应,同时,抗炎作用与阻断NF-κBp50(IκBα)-IL-1β信号通路有关,并以该复方水溶液浓度为含生药3g/m L最为明显[11];由于IL-1β是M1型巨噬细胞的标志炎症因子[13],故我们推测补肾活血方可以通过影响巨噬细胞表型M1/M2极化,以防治绝经后CMD。因此,本研究拟通过制备去卵巢小鼠CMD模型,观察补肾活血方对模型冠脉微血管密度和心肌巨噬细胞M1/M2的标志炎症因子表达的影响,探讨该方对去卵巢小鼠CMD冠脉微血管密度的保护作用及其机制,为提高其治疗绝经后CMD的效果提供可靠的实验依据。第一部小鼠去卵巢CMD模型建立目的:观察小鼠去卵巢后,不同时间的心肌组织结构、冠脉微血管密度变化、内皮细胞损伤程度及心肌收缩功能,制备去卵巢小鼠CMD模型。方法:1)将8W性成熟C57BL/6雌性小鼠分为6W正常组、6W假手术组、6W模型组、8W正常组、8W假手术组和8W模型组等6组。其中,6W和8W模型组为切除小鼠双侧卵巢后,常规喂养6W和8W;6W和8W假手术组为不切除小鼠卵巢,仅切除少许卵巢周围的脂肪组织,常规喂养6W和8W;6W和8W正常组不作任何处理,常规喂养6W和8W。2)4天称1次小鼠体质量,比较各组体质量变化。3)采用小动物超声成像系统采集超声心动图,分析比较各组LVEF和LVFS,评价心肌收缩功能。4)采用HE染色法,观察各组小鼠心肌组织结构。5)采用CD31免疫荧光染色法,统计冠脉微血管密度,衡量CMD模型制备是否成功。采用WGA荧光染色法统计心肌细胞横截面积。6)采用实时荧光定量PCR技术,检测各组血管内皮生长因子VEGF表达水平。结果:1)去卵巢6 W和8 W时,正常和假手术组体质量无明显变化(P>0.05);与假手术组相比,6 W模型组和8 W模型组体质量均明显增加(P<0.05)。2)去卵巢6 W和8 W时,正常、假手术和模型组LVEF和LVFS无明显差异(P>0.05);与8 W假手术组相比,8 W模型组LVEF和LVFS均下降(P<0.05)。3)6W正常、假手术和6W模型组及8W正常和假手术组的心肌细胞均胞浆丰富,结构完整,细胞排列整齐;8W模型组心肌细胞肿胀,横纹模糊,心肌组织出现变性,炎症细胞浸润增多,心肌间质充血。4)去卵巢6 W正常、假手术和模型组及8 W正常和假手术组心肌细胞横截面积无明显差异(P>0.05);与8W假手术组相比,8 W模型组心肌细胞横截面积明显增大(P<0.05)。5)去卵巢6 W正常、假手术和模型组及8 W正常和假手术组冠脉微血管密度之间无明显差异(P>0.05);与8W假手术组相比,8W模型组冠脉微血管密度显著降低(P<0.05)。6)去卵巢6 W正常、假手术和模型组及8 W正常和假手术组心肌组织VEGF m RNA的表达无明显差异(P>0.05);与8W假手术组相比,8W模型组心肌组织VEGF m RNA表达水平降低(P<0.05)。结论:去卵巢8W时,小鼠出现冠脉微血管密度降低,心肌细胞排列紊乱,炎症细胞浸润,血管内皮生长因子减少和心肌收缩功能降低,此时,小鼠去卵巢后CMD模型制备成功。第二部分心肌M1/M2极化在小鼠去卵巢CMD模型中的作用目的:观察去卵巢后CMD小鼠心肌损伤及冠脉微血管密度变化与巨噬细胞数量及其表型M1/M2极化的关系。方法:1)将8W性成熟C57BL/6雌性小鼠分为模型组和巨噬细胞清除组,其中,参照“第一部分实验”制备去卵巢小鼠CMD模型。巨噬细胞清除组腹腔注射氯膦酸二钠脂质体(Clophosome,10μl/g),1次/1W,从去卵巢8W后开始,持续8W。模型组腹腔注射相同体积的生理盐水。2)4天称1次各组小鼠体质量,比较各组体质量变化。3)采用小动物超声成像系统采集超声心动图,分析并比较LVEF和LVFS,评价心肌收缩功能。4)采用HE染色法观察各组心肌组织结构。5)采用荧光染色法分别检测各组心肌中CD31和CD68的表达水平,观察小鼠冠脉微血管密度变化和心肌组织巨噬细胞浸润程度。6)采用实时荧光定量PCR技术检测各组心肌组织中M1标志炎症因子IL-1β和TNF-α和M2标志炎症因子IL-10及VEGF m RNA表达。结果:1)与模型组相比,巨噬细胞清除组体质量变化无统计学意义(P>0.05)。2)与模型组相比,巨噬细胞清除组LVEF和LVFS无统计学差异(P>0.05)。3)与模型组相比,巨噬细胞清除组心肌组织浸润的炎症细胞减少。4)5)与模型组相比,巨噬细胞清除组心肌组织中CD68阳性表达数减少(P<0.05),冠脉微血管密度未见明显差异(P>0.05)。与模型组相比,巨噬细胞清除组心肌组织IL-1β和TNF-αm RNA降低(P<0.05);IL-10和VEGF m RNA表达水平未表现出明显差异(P>0.05)。结论:清除小鼠去卵巢后CMD模型的巨噬细胞后,心肌组织中M1促炎因子的分泌减少,但并未改善冠脉微血管损伤。因此,小鼠去卵巢后CMD的发生发展可能与巨噬细胞向M1极化密切相关,而与巨噬细胞的数量无关。第三部分补肾活血方对小鼠去卵巢CMD模型心肌M1/M2极化的影响目的:观察补肾活血方对小鼠去卵巢后CMD心肌M1/M2极化的标志因子IL-1β、TNF-α与IL-10的影响,探讨其对心肌M1/M2极化的作用。方法:1)将8W性成熟C57BL/6雌性小鼠分为模型组和补肾活血组,其中,参照“第一部分实验”制备去卵巢小鼠CMD模型。补肾活血组灌服中药颗粒剂水溶液5m L/kg/d(浓度为含生药6g/m L),去卵巢8W后开始灌胃,连续8 W,1次/d;模型组灌胃相同体积的生理盐水。2)4天称1次各组体质量,比较各组体质量变化。3)采用小动物超声成像系统采集超声心动图,分析并比较各组LVEF、LVFS,评价各组心肌收缩功能。4)采用HE染色法观察各组心肌组织形态。5)采用荧光染色法检测各组心肌细胞横截面积、超氧阴离子平均荧光强度及心肌中CD31和CD68的表达水平,评价小鼠心肌肥大、超氧阴离子积聚程度、冠脉微血管密度变化及心肌巨噬细胞浸润程度。6)采用实时荧光定量PCR检测心肌IL-1β、TNF-α、IL-10和VEGF m RNA表达。结果:1)与模型组相比,补肾活血组体质量差异无统计学意义(P>0.05)。2)与模型组相比,补肾活血组LVEF和LVFS均显著升高(P<0.05)。3)与模型组相比,补肾活血组心肌组织结构较为完整,炎症细胞浸润减少。4)与模型组相比,补肾活血组心肌细胞横截面积明显减小(P<0.05)。5)与模型组相比,补肾活血组心肌超氧阴离子显著减少(P<0.05)。6)与模型组相比,补肾活血组心肌CD68阳性表达数未见明显差异(P<0.05);补肾活血组冠脉微血管密度增多,其差异具有统计学意义(P>0.05)。7)与模型组相比,补肾活血组心肌IL-1β和TNF-αm RNA表达水平显著降低(P<0.05),IL-10和VEGF m RNA表达水平明显升高(P<0.05)。结论:补肾活血方可能是通过抑制去卵巢CMD小鼠心肌组织中的巨噬细胞向M1极化,促进其向M2极化,以抑制冠脉微血管炎症反应的发生发展,达到修复心肌组织,改善心肌收缩功能和冠脉微血管形态及功能的目的。第四部分补肾活血方对小鼠去卵巢CMD模型心肌miR-155表达的影响目的:观察补肾活血方对去卵巢小鼠CMD模型心肌中M1/M2极化关键调控因子miR-155表达的影响,探讨其影响M1/M2极化的机制。方法:1)将8W性成熟C57BL/6雌性小鼠分为假手术组、模型组、miR-155抑制组和补肾活血组,参照“第一部分实验”制备去卵巢小鼠CMD模型。补肾活血组干预同“第三部分实验”,miR-155抑制组尾静脉注射miR-155抑制剂,2ug/m L,1W/次,持续8W。2)采用实时荧光定量PCR技术检测心肌miR-155、IL-1β、TNF-α、IL-10和VEGF m RNA的表达。结果:1)与假手术组相比,模型组心肌miR-155、IL-1β和TNF-αm RNA表达显著升高(P<0.05),IL-10和VEGF m RNA表达显著降低(P<0.05)。2)与模型组相比,补肾活血组心肌miR-155、IL-1β和TNF-αm RNA表达明显降低,(P<0.05),IL-10和VEGF m RNA表达显著增加(P<0.05)。3)与模型组相比,miR-155抑制组心肌miR-155、IL-1β和TNF-αm RNA表达显著降低(P<0.05),IL-10,VEGF m RNA表达明显升高(P<0.05)。4)与miR-155抑制组相比,补肾活血组心肌miR-155、IL-1β、TNF-α、IL-10和VEGF m RNA表达无统计学差异(P>0.05)。结论:miR-155表达水平与M1型巨噬细胞密切相关,并呈正相关;miR-155表达下调后,抑制了巨噬细胞向M1极化,促进了M2极化;去卵巢后CMD小鼠心肌miR-155表达增多。补肾活血方干预模型小鼠后,心肌miR-155表达减少,因此,补肾活血方抑制去卵巢小鼠CMD模型心肌巨噬细胞向M1极化,促进M2极化,可能与其下调心肌miR-155表达有关。