研究背景及意义骨性关节炎(OA)是一种慢性退行性滑膜关节性疾病,是最常见的关节疾病,主要的症状表现为慢性疼痛和僵硬,除关节软骨破坏外,其他组织如滑膜和软骨下骨也参与疾病的发展,其特征在于透明软骨逐渐消失,导致关节间隙逐渐变窄以及关节周围的骨质变硬,临床主要表现为滑膜炎、软骨退变、骨赘形成等。膝关节骨性关节炎(KOA)按病因分为原发性KOA和继发KOA。通常人们所认为的骨性关节炎属于原发性KOA,是指用当前所有的检测手段都不能明确发病原因的骨性关节炎。创伤、内分泌以及类风湿性关节炎等疾病,它们有非常明确的致病因素,所导致的骨性关节炎,称之为继发性骨性关节炎,这一类骨关节炎不伴有赫伯登结节,病变比较局限。按照部位可分为局灶性膝骨性关节炎和全身性膝骨性关节炎,按照是否有临床症状可分为无症状性膝骨性关节炎和症状性膝骨性关节炎。KOA早期可能是由直接损害和机械应力破坏组织引起,但在疾病发展的很长一段时间里,细胞介导过程的逐渐参与和演变起着非常重要的作用。大家一致认为患者表现出来的常见症状和关节功能异常是由不同的病理生理途径和各种风险因素独立或联合导致的结果。然而,目前膝骨关节炎的发病机制尚未完全清楚。肥胖、创伤、年龄、性别(女性更常见)和生化因素是OA的主要危险因素。关节炎的关节软骨和骨的细胞外基质(ECM)破坏被认为是过度的蛋白水解活性介导的。骨性关节炎最基本的病理改变是关节软骨的损伤退变。关节软骨主要由细胞外基质和软骨细胞构成,属于透明软骨的一类,关节软骨中不存在血管、淋巴引流和神经。软骨细胞是关节软骨中仅有的一种细胞,在骨性关节炎的致病过程中发挥着重要的作用。软骨细胞外基质包括一些特殊的高度交联的胶原,这些胶原与特定的胶原、基质蛋白以及蛋白多糖相互作用。带负电的聚集蛋白聚糖分子、纤维胶原网分别使关节的表面不但拥有很强的张力,还拥有一定的硬度。在软骨基质中,Ⅵ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ型胶原等具有重要的功能,但是成分含量较少。聚集蛋白聚糖的核心蛋白是以共价键结合的糖胺多糖,由硫酸软骨素和硫酸胶质素构成。软骨中蛋白多糖的最主要成分是聚集蛋白聚糖以非共价键与透明质酸的多具体结合构成的聚集体。其它一些小的富含亮氨酸的蛋白聚糖,其中就包括双糖链蛋白多糖、基模聚糖和核心蛋白多糖、纤调蛋白聚糖等,可以参与稳定电荷密度、与胶原网相互影响、增强生长因子的锚定效果促进软骨的结构进一步稳定。蛋白聚糖可以分散软骨组织的负荷和防御外来压力,维持细胞外基质的水分子,而胶原蛋白可以增强软骨组织的抗拉性。整合素是一种表面粘附受体,主要的功能是介导细胞和细胞外基质之间的关联粘附。整合素在软骨细胞中,使得传导软骨内的信号和机械应力加强刺激,调节软骨细胞的基因表达和功能。在正常的生理条件下,软骨细胞的合成和分解维持着动态平衡,而在骨性关节炎中关节软骨的实验研究中指出,骨性关节炎发病的主要原因是软骨组织合成与分解之间的平衡关系被破坏。多年来,医学工作者试图找到调节OA的致病基因和因子,但一直争论颇多。现有的研究资料表明,大量的基因和细胞因子通过多种激活途径产生生物学效应参与骨性关节炎的发病过程,而软骨的修复能力一旦破坏几乎不能逆转。因此,明晰其病变的调控机制,在病变的早期进行干预,缓解关节软骨破坏或者是促进软骨修复,是医学工作者必须面对的挑战。随着分子生物学的发展,对骨性关节炎的认识已深入到分子水平。研究发现,多种细胞因子(IL-1、IL-2、IL-5、IL-6、IL-17、IL-8、TGF、VEGF、IGF等)、粘附分子(整合素)、抑制/激活因子(丝氨酸纤溶酶原激活因子)、蛋白酶类(MMP)等参与骨性关节炎的致病过程。促炎因子包括IL-1、IL-2、IL-5、IL-6、IL-17、IL-8、TNF、MMPs、PGE2、趋化因子等,炎症抑制因子包括IL-4、IL-10、IL-13、IGF、TGF等。白介素17(interleukin 17,IL-17)是一种新的以二聚体形式分泌的促炎性的细胞因子,由激活的人记忆性T细胞的亚型、T细胞、鼠的胸腺细胞等特定细胞合成。于1993年Rouvier等发现了细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA)的cDNA序列。Yao等发现:CTLA-8主要是由两种蛋白构成。人的CTLA-8是一种同型二聚体,重组CTLA-8有两种形式表达:糖基化与非糖基化。所以将CTLA-8更名为IL-17。IL-17的结构特殊,mRNA中富含腺嘌呤-尿嘧啶重复序列,易导致mRNA降解,在结构上与其它已知的白介素和蛋白无相似性。人的IL-17A与兔和鼠的IL-17A有很高的结构同源性,并且都有显著的糖基化位点。人IL-17是一种分子量为2万～3万的分泌型糖蛋白。众所周知目前IL-17家族有 6 个成员(IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F),具有很高的同源性,这是一组在脊椎动物进化中高度保守的蛋白。IL-17是由激活的辅助性T细胞产生,少数在自然杀伤细胞、中性粒细胞中表达。IL-17通过IL-1、IL-8、IL-6、巨噬细胞炎症蛋白等多种细胞因子多种途径参与膝关节炎的发病。Messier S等发现IL-17在滑液的软骨细胞上影响局部IL-8和IL-1β的表达,同时能增加NO的产量,目前已经证实NO增加的水平与IL-17的表达量呈正相关性。IL-17还能联合IL-6上调成骨细胞环氧合酶2和前列腺素E2的水平,促进自由基失衡和NO生成。有研究表明,IL-17可以增强关节炎软骨中软骨血管的形成,同时活化和增多血管内皮生长因子,加剧炎症反应,容易引发骨质纤维化增生。IL-17是近年提出的炎症信号因子,在病人的滑液,半月板,软骨细胞中普遍存在。IL-17可能在膝关节骨性关节炎的发病机制中发挥关键作用,滑膜液IL-17浓度可能是反映膝骨关节炎严重程度和进展的生化指标。本文通过酶联免疫吸附试验(ELISA)及免疫组织化学的方法检测OA患者与非骨关节炎患者的血清、滑液、滑膜中IL-17的表达量,采用细胞生物学及分子生物学实验方法,如MTT、Western blot、TUNEL研究IL-17A对软骨细胞增殖、凋亡及各个炎性指标的表达情况,研究KOA患者血清、滑液和滑膜中IL-17的水平,并研究其与关节软骨损伤和滑膜炎严重程度的关系,进一步了解骨关节炎发生发展的分子机制以及相关炎症因子的作用,为骨关节炎的诊断和治疗提供新思路。IL-17在骨关节炎中的表达及引起炎症反应的机制目的:骨关节炎(OA)是关节炎最常见的形式,多种细胞因子参与OA的致病过程。其中,IL-17是近年来发现的一种炎症相关信号因子,在骨关节炎患者的滑液,半月板,软骨细胞中广泛存在。观察IL-17在膝关节骨关节炎(KOA)患者及非膝关节骨关节炎患者的血清、滑液及滑膜中表达量的差异及其相关性,探讨IL-17在KOA致病过程中的作用;通过体外细胞培养软骨细胞,并用IL-17A刺激后观察细胞的形态学的变化,与正常的软骨细胞进行形态学上的比较,为进一步研究IL-17在发病机制中的分子通路提供线索。通过探索膝关节骨关节炎患者的严重程度与血清和滑液中IL-17的关系,以及IL-17引起软骨细胞炎症反应的机制,有助于进一步认识骨关节炎发病的分子机制以及相关炎性因子的作用,为骨关节炎的诊断和治疗提供新思路。方法:1.根据美国风湿病学会骨关节炎(OA)诊断标准,选取2012年6月至2014年6月在我院行关节镜手术的病例,其中膝关节骨关节炎(KOA)及关节疾病(非KOA组)各46例,以非KOA组作为对照。ELISA法检测滑膜液和血清中IL-17水平,免疫组织化学法检测滑膜中IL-17水平。通过Outerbridge和Ayral评分对膝关节软骨破坏程度、滑膜炎的程度进行评价。2.体外培养软骨细胞,使用IL-17A(0、10、100ng/ml)刺激24小时后,倒置显微镜下观察细胞形态变化,使用MTT法检测细胞活性,TUNEL法检测细胞凋亡情况。运用ELISA检测细胞上清液中PGE2的表达量,运用Western blot检测细胞中ADAMTS-7、COMP、COX2蛋白量的变化。分析各指标的表达量与IL-17A的刺激浓度的相关性,明确IL-17A是否引起软骨细胞活性和凋亡变化,并从分子水平上探讨炎症反应发生的机制。结果:1.KOA组关节滑液和滑膜中IL-17水平明显高于非KOA组(P<0.05)。在KOA组的滑膜液和滑膜中IL-17的水平与血清中高敏C反应蛋白(HS-CRP)水平及Outerbridge评分和Ayral评分呈正相关。2.显微镜下观察IL-17A刺激软骨细胞后,可见少量漂浮细胞,且细胞伪足减少,贴壁细胞数减少。MTT结果显示,与对照组相比,低剂量组和高剂量组细胞活性降低明显(P<0.05,P<0.01)。TUNEL染色可见IL-17可诱导软骨细胞发生凋亡,使软骨细胞数减少,细胞凋亡率增加。随着IL-17的浓度的增加,PGE2、ADAMTS-7、COX2蛋白表达量逐渐增高,与对照组相比高剂量组变化显著。COMP蛋白表达量逐渐减少,与对照组相比高剂量组变化显著。结论:1.KOA患者的滑膜液和滑膜中的IL-17水平增加并且与KOA严重性呈正相关。2.IL-17A的刺激可改变软骨细胞形态,抑制软骨细胞活性,引起一系列的炎症反应,导致软骨细胞凋亡。3.在体外细胞培养中,IL-17A刺激软骨细胞可以显著上调PGE2、ADAMTS-7、COX2,下调COMP,激活相关的炎症通路,从而在OA的发生发展中起关键作用。