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中国是一个肝病高发的国家,原发性肝癌的发病率高达25.7/100000,而且呈逐年增加趋势。每年约有28万人死于肝癌,占世界死亡人数的53%。迄今为止,肝病的诊断和治疗,尤其是肝癌的诊断和治疗,仍然具有挑战性。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占肝癌总发病率的90%以上。肝细胞癌患者根据肿瘤的分化等级不同,可以有截然不同的治疗反应和总体效果。因此,对肝细胞癌分化等级的清晰准确区分具有巨大的临床价值。目前,肝细胞癌分化等级很难分类,仅仅只依赖于相关病理医生的专业知识和诊断所需要的时间。尽管结合不同的指标,研究人员开发了各种不同的分级和分期系统,用于选择治疗方案和预测预后。但传统的分级系统,最初是为肝病制定的,更多关注的是癌症发展过程中定性而非定量的特征。例如Child-Pugh评分系统,MELD评价系统(终末期肝病模型),CLIP评分法,Oknda分期系统,TNM分期系统。因此建立基于胶原纤维特征的预测模型具有重要的临床意义。多光子显微术(Multiphoton microscopy,MPM)是基于飞秒激光与生物组织内在成分相互作用后发生激发荧光和谐波产生等非线性光学效应而发展起来的一种新兴的非线性光学成像技术,具有高空间分辨率、低细胞损伤、大成像深度和可应用于组织三维成像等优点。MPM收集到的二次谐波产生(SHG)信号和双光子激发荧光(TPEF)信号提供了常规病理学中所没有的额外的定量信息和特异性,被广泛应用在肝脏的基础研究和临床研究中,已成为生物医学光学领域的研究热点。然而,多光子显微术用于肝细胞癌分化等级研究尚属空白。基于此,本文利用MPM对不同分化等级的肝细胞癌进行深入研究,包括针对肝细胞癌样品信号弱的缺陷开发LSIE-MPM算法,对肝细胞癌高中低分化的图像进行分类,利用卷积神经网络对肝细胞癌的高中低分化等级进行自动区分,将肝细胞癌高中低分化等级同预后建立预测模型。主要内容归纳如下:首先,为了克服肝脏组织内源性信号弱的缺点,本论文结合了卡方变换函数和亮度变换函数模型,开发了低信号增强算法(LSIE-MPM)。该方法首次应用于MPM成像,在植物细胞,新鲜卵巢组织和实时视频等不同类型的MPM图像上验证后,最终应用于不同分化等级的肝细胞癌多光子图像的信号增强。结果表明,LSIE-MPM使多光子图像的信号得到显著增强,有效信息清晰可见,同时避免了激光对样品的损伤。与此部分相关的主要成果发表于Journal of Physics D:Applied Physics,2019,52:285401(SCI-Ⅱ,IF=2.829)。其次,本论文将MPM用于肝细胞癌的石蜡包埋样品,开展了高中低分化等级的无标记分类研究,经过特征提取和特征选择,Mann-Whitney检验和接受者操作特征曲线分析来自肿瘤内胶原的SHG信号。结果显示软件分析与经验丰富的病理学家的诊断之间具有良好的相关性。结合图像特征和临床信息,生成自适应量化算法以自动确定肝细胞癌分化等级。结果表明,MPM可能是临床使用中有前景的自动诊断方法,无需耗时进行组织处理和染色。与此部分相关的主要成果发表于BIOMEDICAL OPTICS EXPRESS,2018,9(8):3783-3793(SCI-Ⅱ,IF=3.91)。进一步地,本论文开展了MPM和卷积神经网络算法融合的研究,用于区分肝细胞癌的分化等级,以产生创新的计算机辅助诊断方法。基于VGG-16框架的卷积神经网络使用包含TPEF信号和SHG信号的合成图像进行训练。由此产生的肝细胞癌分化等级的分类准确度超过90%。结果表明,MPM和卷积神经网络相结合可以实现各种组织、疾病和其他相关分类问题的无标记自动化方法。与此部分相关的主要成果发表于JOURNAL OF BIOPHOTONICS,2019,12(7):e201970024(SCI-Ⅱ,IF=3.763)。最后,为了证明肝细胞癌的分化等级与预后密切相关,本论文选取肿瘤内胶原特征的改变与肝外转移和复发两个预后重要指标相结合,建立了一个多元逻辑回归模型:Collagen Score(CS)。CS模型将多光子显微镜下的胶原特征与分化等级等临床信息相结合,对肝外转移和复发的预测准确率分别为95.3%和71.6%。结果表明,胶原纤维可作为稳定且无标记的预后标志物。与此部分相关的主要成果“Collagen Score:A Novel Method for Predicting the Prognosis of Liver Cancer”正在投稿中。总之,通过本论文的研究工作,填补了多光子显微术在肝细胞癌分化等级方面的研究空白,开拓了基于多光子显微术的计算机辅助诊断新方法。