第一部分食管鳞状细胞癌患者Bin1基因启动子甲基化状态及其意义目的:通过检测桥接整合因子-1(bridging integrator-1,Bin1)基因在食管鳞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)患者癌组织和其癌旁组织中表达情况及其启动子甲基化状态,分析在ESCC患者中Bin1甲基化状态与其表达及临床病理特征的关系,探讨Bin1基因甲基化在ESCC临床中的意义,为Bin1基因甲基化作为新靶点应用于ESCC综合治疗提供理论依据。方法:1收集2014年6月至2015年6月期间河北医科大学第四医院胸外科手术切除的58例ESCC患者的癌组织和癌旁组织,并将每例标本分为3份,其中2份标本取下后迅速置于液氮罐中,后放置于-80℃超低温冰箱中贮存以备提取RNA、DNA时使用;另1份以4%甲醛溶液固定以备制作蜡块时使用,用于免疫组织化学。2采用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)、甲基化特异性PCR(Methylation-Specific polymerase Chain Reaction,MSP)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)分别检测58例经病理证实的ESCC患者的癌组织、癌旁组织中Bin1蛋白的表达情况、Bin1基因的表达情况和Bin1基因启动子甲基化状态,分析ESCC中Bin1甲基化状态与Bin1蛋白、基因表达情况及与患者临床病理特征之间的关系。结果:1在58例食管鳞癌患者中,ESCC组织中Bin1蛋白低表达发生率明显高于相应癌旁组织[37/58(63.79%)vs.13/58(22.41%),P<0.01];在58例ESCC患者中,ESCC组织中Bin1 mRNA的表达水平明显低于癌旁组织,分别为(0.78±0.05)vs.(1.03±0.03)(t=9.643,P<0.01);Bin1发生甲基化的组织中Bin1 mRNA表达水平显著低于未发生甲基化的组织,分别为(0.68±0.04)vs.(0.85±0.07)(t=2.476,p<0.05),bin1基因呈低表达的患者有35例,是bin1蛋白低表达的患者的94.59%。这一结果提示,在escc组织中bin1在基因水平和蛋白水平的表达一致。2在35例bin1mrna呈低表达的escc组织中有32例(91.43%)bin1基因启动子发生甲基化,在37例bin1蛋白呈低表达的escc组织中有33例(89.19%)bin1基因启动子发生甲基化;说明在escc组织中bin1启动子区的异常甲基化与bin1的低表达相关,且bin1甲基化是bin1在escc组织中低表达的原因之一。3bin1甲基化状态与患者tnm分期、肿瘤侵犯深度、分化程度、淋巴结转移相关(p<0.05),与患者年龄、性别比较无统计学意义(p>0.05)。结论:食管癌患者肿瘤组织中bin1呈高甲基化状态,bin1高甲基化状态与食管癌患者肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、tnm分期等临床病理特征密切相关。第二部分bin1基因启动子甲基化状态在食管鳞癌发生发展中的作用目的:通过检测escc细胞yes-2、te13、te1、kyse30和ec109中bin1表达情况和甲基化状态,选择yes-2和te13细胞进行后续实验,应用去甲基化药物5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-aza-2’deoxycytidine,5-aza-dc)作用于yes-2和te13细胞,分析去甲基化前后bin1表达水平、escc细胞增殖、凋亡等恶性生物学行为和emt相关蛋白的变化,探讨bin1在escc发生发展的可能机制,为bin1基因甲基化作为新靶点应用于escc综合治疗提供实验依据。方法:1分别采用qrt-pcr、msp方法检测bin1在5种人食管鳞癌细胞yes-2、te13、te1、kyse30和ec109中的表达情况及甲基化状态,选出yes-2和te13进行后续实验。使用去甲基化药物5-aza-dc对两种escc细胞进行干预,并分别用msp、western-blot对两种escc细胞进行检测,分析bin1甲基化状态与其表达的变化情况。2采用mtt、克隆形成实验、流式细胞术检测yes-2和te13细胞去甲基化前后增殖能力的改变情况,分析bin1甲基化对escc细胞增殖能力的影响。3采用流式细胞术(flowcytometryassay,fcm)检测yes-2和te13细胞去甲基化前后增殖、凋亡能力的改变情况,分析bin1甲基化对escc细胞增殖、凋亡能力的影响。4采用细胞划痕实验、transwell实验检测yes-2和te13细胞去甲基化前后迁移、侵袭能力的改变情况,分析bin1甲基化对escc细胞迁移、侵袭能力的影响。5采用westernblot实验检测yes-2和te13细胞去甲基化前后上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)相关蛋白e钙粘蛋白(e-cadherin,e-cad)、n钙粘蛋白(n-cadherin,n-cad)、基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,mmp-2)、基质金属蛋白酶9(mmp-9)等表达的改变情况,探讨bin1甲基化影响escc细胞的上皮间质转化的发生情况。结果:1bin1mrna在te13、te1、kyse30、ec109和yes-2五种escc细胞中均呈低表达状态(p<0.01);五种escc细胞均为甲基化状态,其中yes-2和te1两种细胞为完全甲基化状态;经5-aza-dc去甲基化处理后,yes-2、te13、te1为非甲基化状态;筛选出yes-2和te13细胞进行后续实验;经5-aza-dc去甲基化处理后yes-2和te13两种人escc细胞bin1蛋白表达提高(p<0.01)。2mtt结果显示,经不同浓度(30μm、60μm、90μm)5-aza-dc干预yes-2细胞后d2天,细胞的增殖抑制率分别为6.7±0.9%、12.3±1.7%和15.4±2.1%,培养d7天时,细胞的增长抑制率分别为7.3±1.0%、49.3±5.7%和59.6±6.3%,与浓度为0μm的对照组相比,细胞增殖率显著降低;经不同浓度(30μm、60μm、90μm)的5-aza-dc干预te13细胞后d2天,细胞的增殖抑制率分别为6.4±0.8%、11.9±1.7%和15.1±2.0%,培养d7天时,细胞的增长抑制率分别为7.0±1.1%、47.2±5.6%和57.2±5.9%,与浓度为0μm的对照组相比,细胞增殖率显著降低(p<0.01)。克隆形成实验结果显示:经不同浓度(0μm、30μm、60μm、90μm)5-aza-dc干预yes-2细胞后,细胞的克隆数分别为(233±29)、(189±23)、(105±16)和(71±11),与浓度为0μm的对照组相比,克隆数明显降低;经不同浓度(0μm、30μm、60μm、90μm)5-aza-dc干预te13细胞后,细胞的克隆数分别为(281±33)、(235±28)、(139±19)和(83±12),与浓度为0μm的对照组相比,克隆数明显降低。说明yes-2和te13细胞经去甲基化处理后增殖活性均显著下降(p<0.01)。3流式细胞术结果显示,经不同浓度(0μm、30μm、60μm、90μm)5-aza-dc干预yes-2细胞后,细胞处于g0/g1期的百分比分别为:(37.2±3.1)%、(46.5±3.9)%、(58.2±4.3)%和(70.7±4.9)%,处于s期的百分比分别为:(50.6±4.2)%、(42.7±3.6)%、(26.6±3.1)%和(20.5±2.4)%,与浓度为0μm的对照组相比,细胞处于g0/g1期的百分比明显升高,处于s期的百分比明显降低;经不同浓度(0μm、30μm、60μm、90μm)5-aza-dc干预te13细胞后,细胞处于g0/g1期的百分比分别为:(33.7±2.8)%、(39.4±3.6)%、(47.3±3.9)%和(56.3±4.5)%,处于s期的百分比分别为:(70.2±4.5)%、(58.3±4.2)%、(45.2±3.1)%和(32.6±2.8)%,与浓度为0μm的对照组相比,细胞处于g0/g1期的百分比明显升高,处于s期的百分比明显降低。说明经去甲基化处理后,escc细胞周期发生改变,处于s期的细胞显著下降,阻滞于g0/g1期的细胞显著上升(p<0.01)。流式细胞术结果显示,经不同浓度(0μm、30μm、60μm、90μm)5-aza-dc干预yes-2细胞后,处于凋亡的细胞百分比为:(4.12±0.89)%、(7.49±1.34)%、(10.03±2.13)%和(13.07±2.47),与浓度为0μm的对照组相比,处于凋亡的细胞百分比明显提高(p<0.01);经不同浓度(0μm、30μm、60μm、90μm)的5-aza-dc干预te13细胞后,处于凋亡的细胞百分比为:(3.57±0.78)%、(8.09±1.43)%和(10.15±2.08)%、(15.64±2.55),与浓度为0μm的对照组相比,处于凋亡的细胞百分比明显提高(p<0.01)。上述实验结果说明bin1基因去甲基化后可以抑制yes-2和te13细胞的增殖能力和促进其凋亡,对于escc细胞的恶性生物学行为具有抑制作用。4划痕实验结果显示:发现经5-aza-dc去甲基化处理后,yes-2细胞的48h迁移距离为(57.7±4.5)μm,未经去甲基化处理的48h迁移距离为(122.4±9.4)μm,去甲基化处理后的yes-2细胞迁移距离明显短于处理前,其结果具有统计学意义(p<0.01);te13细胞经5-aza-dc去甲基化处理后的48h迁移距离为(64.2±4.8)μm,未经去甲基化处理的48h迁移距离为(133.4±8.1)μm,去甲基化处理后的te13细胞迁移距离明显短于处理前,其结果具有统计学意义(P<0.01)。YES-2和TE13细胞迁移距离显著缩短,说明Bin1经去甲基化处理后能够抑制YES-2和TE13细胞的迁移能力。Transwell实验结果显示,经不同浓度(0μM、30μM、60μM、90μM)的5-Aza-d C去甲基化处理后的YES-2细胞,穿过Matrigel滤膜的细胞数分别为(206±35)、(137±29)、(78±18)和(39±9),与浓度为0μM的对照组相比,穿过Matrigel滤膜细胞术明显减少(P<0.01)。经不同浓度(0μM、30μM、60μM、90μM)的5-Aza-dC去甲基化处理后的TE13细胞,穿过Matrigel滤膜的细胞数分别为(289±42)、(145±33)、(57±16)和(48±12),与浓度为0μM的对照组相比,穿过Matrigel滤膜细胞术明显减少(P<0.01)。YES-2和TE13细胞穿膜细胞数显著减少,说明Bin1经去甲基化处理后能够抑制两种细胞的侵袭能力。上述实验说明说明Bin1经去甲基化后能够抑制YES-2和TE13细胞的迁移、侵袭能力。5 Western blot检测结果显示:ESCC细胞YES-2和TE13经5-Aza-dC处理后,EMT相关蛋白E-cad表达上调(P<0.01),N-cad、Snail、MMP-2和MMP-9蛋白的表达下调(P<0.01),说明Bin1去甲基化处理后能够改变YES-2和TE13细胞EMT相关蛋白的表达从而抑制上皮间质转化的发生。结论:体外实验证实Bin1甲基化影响食管癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力,通过抑制食管癌细胞上皮间质转化过程影响食管癌发生发展。