重组菊酸乙酯酯酶的固定化及催化合成手性菊酸的研究

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菊酸乙酯酯酶是迄今为止发现的唯一一个能立体选择性地水解(+)-反式-菊酸乙酯为(+)-反式-菊酸和乙醇的酶。与其它胞内存在的菊酸乙酯酯酶不同,本文研究的菊酸乙酯酯酶是分泌在工程菌细胞胞外的游离重组酶。本文考察了游离菊酸乙酯酯酶的最适pH值、pH稳定性、最适温度、温度稳定性等特性,并研究了游离菊酸乙酯酯酶催化水解菊酸乙酯的反应条件。试验结果表明:游离菊酸乙酯酯酶在pH9.0~10.5范围内酶活较高,最佳pH为10,属碱性酯酶;该酶在温度35~55℃范围内都有较明显的催化活力,最适温度为45℃。在反应温度50℃条件下、反应时间48h,(+)-反式-菊酸的纯度可达97%,转化率可达到100%。为了该酶工业化,获得高效的固定化菊酸乙酯酯酶,本文筛选了多种固定化载体,研究了用DEAE纤维素固定菊酸乙酯酯酶的条件以及DEAE纤维素固定化酯酶的各种性质。研究结果表明,相比较其它载体而言,以DEAE纤维素为载体的固定化酯酶具有较高的酶活和稳定的操作性,工业化前景良好。用2%的戊二醛交联DEAE纤维素2h后,每克载体和20ml酶液固定化6h能达到最佳固定化效果。固定化酯酶的最佳pH值和温度分别为10.5和50℃。菊酸乙酯酯酶固定化后pH稳定性、热稳定性和操作稳定性都得到了较大的提高。本论文还研究了固定化酯酶催化水解菊酸乙酯的反应条件。结果表明,水解反应中底物和产物对反应均有不同程度的抑制作用,底物浓度大于4%,产物浓度高于10%时对反应转化率和反应初速度抑制作用比较明显;固定化酶的用量为5%时,转化率最高,继续增加酶量对反应没有促进作用。最后,本论文对酶反应器和(+)-反式-菊酸的分离纯化进行了初步的摸索,发现在填充床反应器中,反应转化率和产物对映体过量值可以满足工业化要求,分离纯化后的产物纯度可达97.2%,具有较好的工业化前景。
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