目的：临床资料和法医尸检报告证实，在交通事故、刑讯逼供、虐待等事件中，非致命性机械性损伤后伤员经常发生肾损害、肾衰乃至死亡。由于机械性损伤本身不足以致人死亡，因此常常由于死亡原因不能确定而引起争议，导致案件久拖不决，给社会造成不良影响。此外，在临床实践中也经常发生受伤患者在治疗期间病情加重，致使医务人员难以应对，医患关系紧张。因此研究此类损伤引发肾损伤的确切机制是法医病理学亟待解决的科学技术问题。损伤作为躯体应激原可引起机体应激反应；此外当事人在遭受损伤后往往会产生焦虑、紧张或抑郁等不良情绪，作为心理社会因素常引起机体超常应激反应，这种情况常被忽视。应激时，机体通过神经内分泌系统的协调作用对应激原作出整体反应，如蓝斑-交感-肾上腺髓质系统和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的强烈兴奋，并伴有多种内分泌激素的改变。本室前期研究证明，束缚应激可加重挤压伤大鼠肾脏损伤，表明应激在肾损伤发生中可能发挥重要作用，但机制尚不清楚。内质网是细胞内蛋白质折叠和成熟的场所。大量的研究表明应激激素及其代谢性产物，细胞因子，氧自由基等均可干扰蛋白质加工运输，引发内质网应激(endoplamic reticulum stress, ERS)。ERS是应激时重要的细胞反应之一，其本质上对于增强细胞对损伤的抵抗及适应能力具有重要意义，但过度强烈或持续时间过长的ERS可通过诱导凋亡和炎症反应造成组织、细胞损伤。大量研究表明，ERS可能是多种肾损伤发生的重要因素之一，但非致命性机械性损伤导致肾损伤的机制是否与ERS有关尚不明确。挤压伤模型是公认的复制肢体软组织挫伤的动物模型，束缚应激模型是公认的复制心理社会应激的动物模型。因此，为模拟实际案情，明确应激性损伤机制，本实验将采用束缚应激加挤压伤的复合模型即应激性损伤模型，探讨束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制是否与ERS有关，为揭示非致命性机械性损伤导致肾损伤的确切机制提供实验依据。此外，实际法医检案中，免疫组织化学(Immunohisto chemistry，IHC)染色技术的应用受到组织固定时间和死后变化等因素的影响。故本实验拟在明确ERS在应激性肾损伤中的作用机制后进一步探讨死后组织固定时间和环境温度对内质网应激相关蛋白抗原稳定性的影响，以期为非致命性机械性损伤及应激参与的死亡案件的死因鉴定提供理论依据，为建立诊断应激性损伤的指标体系提供实验技术方法。第一部分大鼠应激性损伤模型的建立以及肾脏内质网应激的激活目的：建立应激性损伤模型，观察大鼠肾损伤的组织形态学变化和超微结构的变化，并从整体水平探讨大鼠应激性肾损伤时，ERS是否参与束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的过程。方法：实验分为正常对照组，禁食水组，束缚应激组，挤压伤组，应激性损伤(即束缚应激+挤压伤复合模型)组，溶剂DMSO对照组，Salubrinal (ERS抑制剂)组，Salubrinal+应激性损伤组，每组5只大鼠。于造模成功后处死大鼠，取材。每天实验后分别称取正常组、禁食水组和束缚应激组大鼠体重，以评估是否建立束缚应激模型。采用高效液相色谱-电化学检测法(highperformance liquid chromatography coupled to electrochemical detection,HPLC-ECD)，检测血浆中NE、E的含量变化；应用Western blot方法检测应激性肾损伤时GRP78蛋白表达水平；采用透射电子显微镜(transmissionelectron microscope, TEM)技术观察大鼠肾脏的超微结构变化；采用苏木素-伊红(Hematoxylin and Eosin, HE)染色法观察大鼠后肢肌肉组织、肾脏损伤的形态学变化；采用苦味酸法检测血浆中肌酐(creatinine, Cre)的含量变化；采用二乙酰肟法检测血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)的含量变化。结果：1大鼠后肢肌肉组织病理学观察与正常对照组相比，挤压伤组和应激性损伤组大鼠后肢肌肉组织均可见横纹肌溶解，间质出血水肿伴炎细胞浸润，该结果提示大鼠存在软组织损伤，故本实验成功的建立了大鼠挤压伤模型。2大鼠体重的变化正常对照组大鼠体重逐渐增加。而与正常对照组和禁食水组相比，束缚应激大鼠体重增长明显减缓(p<0.05)，该结果提示本实验成功的建立了束缚应激模型。3大鼠血浆中NE、E浓度变化与正常对照组相比，束缚应激组和挤压伤组大鼠血浆中NE、E的浓度明显升高(p<0.05)。该结果提示束缚应激和挤压伤均能引发应激反应。而与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠血浆中NE、E的浓度明显升高(p<0.05)。与正常对照组相比，应激性损伤组大鼠血浆中NE、E的浓度分别增高了2.29倍和3.30倍。这一结果提示，应用束缚应激后挤压的方式成功建立了应激性损伤模型，双重应激原共同刺激引发了机体超常应激反应。4大鼠肾脏组织超微结构观察禁食水组大鼠肾小管细胞核周间隙增大，内质网高度扩张，线粒体嵴和膜融合。束缚应激组大鼠肾小管细胞核固缩，核周间隙增大，内质网扩张，线粒体嵴和膜融合，质膜内褶排列紊乱。挤压伤组大鼠肾小管扩张，线粒体嵴和膜模糊融合，粗面内质网空泡化，细胞核轻度固缩。与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠肾脏组织超微结构损伤最明显，肾小管细胞核周间隙增大，染色质轻度边移，核周细胞器减少，线粒体外膜基本消失，内质网扩张，质膜内褶排列紊乱，肾小管细胞膜破裂。该结果提示束缚应激加重挤压伤大鼠肾脏超微结构损伤。5Western blot检测GRP78蛋白的表达与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠肾脏GRP78的表达明显增高(p<0.05)，而给予ERS抑制剂Sal可明显抑制应激性损伤诱导的GRP78表达升高(p<0.05)。该结果提示Sal可明显抑制ERS的启动，故本实验进一步观察了应用Sal后应激性肾损伤的形态学变化。6大鼠肾脏组织病理学观察与正常对照组相比，挤压伤组大鼠可见肾小球肿胀充血，少量炎细胞浸润及间质充血，而束缚应激组大鼠除可见上述病理改变外，尚可见炎细胞浸润。与挤压伤组大鼠相比，应激性损伤组大鼠肾脏组织病理学变化最明显，可见肾小球肿胀淤血，肾小管上皮细胞脱落，大量炎细胞浸润，间质淤血。该结果表明束缚应激可加重挤压伤大鼠肾损伤。而应用ERS抑制剂Sal可明显减轻应激性损伤组大鼠肾损伤程度。而DMSO组和Salubrinal组大鼠肾脏仅可见少量的炎细胞浸润。该结果提示ERS可能参与了束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的过程。7大鼠血浆Cre和BUN含量的变化与正常对照组相比，束缚应激组和挤压伤组大鼠血浆中Cre和BUN的浓度明显升高(p<0.05)。该结果提示束缚应激和挤压伤均能引发肾损伤。而与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠血浆中Cre和BUN的浓度明显升高(p<0.05)。该结果表明束缚应激可加重挤压伤大鼠肾损伤。而应用ERS抑制剂Sal可明显减轻应激性损伤组大鼠肾损伤程度。该结果提示ERS可能参与了束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的过程。小结：本部分实验成功建立大鼠应激性损伤模型，ERS抑制剂可减轻应激性肾损伤，初步证实ERS可能参与了束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的过程。第二部分ERS介导的束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制研究实验一、ERS介导的束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的凋亡机制目的：建立应激性损伤模型，从整体水平研究ERS诱导凋亡是否参与了束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的过程。方法：分组同第一部分实验。应用Western blot方法检测应激性肾损伤时ERS诱导凋亡的特异性蛋白CHOP、caspase-12和凋亡终末执行分子caspase-3蛋白表达水平；采用原位末端标记技术(TdT-mediated dUTP nickend labeling, TUNEL)观察大鼠肾脏的细胞凋亡情况。结果：1Western blot检测CHOP、caspase-12和caspase-3蛋白的表达与正常对照组相比，束缚应激组和挤压伤组大鼠肾脏CHOP、caspase-12和caspase-3表达均明显增高(p<0.05)。与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠肾脏CHOP、caspase-12和caspase-3的表达均更加显著增高(p<0.05)。而应用ERS抑制剂Sal均可明显抑制上述蛋白的变化(p<0.05)。该结果提示束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制与ERS诱导的细胞凋亡有关。2TUNEL法检测肾脏组织细胞凋亡情况与对照组相比，束缚应激组和挤压伤组大鼠肾脏组织阳性细胞数目均明显增多(p<0.05)；与挤压组相比，应激性损伤组大鼠肾脏组织的凋亡细胞数更加明显增加(p<0.05)，而应用Sal可使凋亡细胞数明显减少(p<0.05)。该结果证实束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制确实与ERS诱导的细胞凋亡有关。实验二、ERS介导的束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的炎症机制目的：建立应激性损伤模型，从整体水平研究ERS诱导的炎症反应是否参与了束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的过程。方法：分组同第一部分实验。应用Western blot方法检测应激性肾损伤时单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)的蛋白表达水平；肾组织固定石蜡包埋后，连续切片，采用IHC法观察大鼠肾脏的GRP78和MCP-1的表达情况。结果：1Western blot检测大鼠肾脏MCP-1蛋白的表达与正常对照组相比，束缚应激组和挤压伤组大鼠肾脏MCP-1表达均明显增高(p<0.05)。与挤压伤组相比，应激性损伤组大鼠肾脏MCP-1的表达更加明显增高(p<0.05)，同时，应用Sal可明显抑制MCP-1的表达(p<0.05)。该结果提示束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤的机制与ERS诱导的MCP-1相关的炎症反应有关。2IHC法检测大鼠肾脏GRP78和MCP-1的表达与正常对照组相比，连续切片染色可见应激性损伤组大鼠肾脏组织相同部位同时存在明显增高是GRP78和MCP-1的阳性表达。该结果为ERS诱导与MCP-1相关的炎症反应提供了形态学上的证据。小结：束缚应激加重挤压伤大鼠肾损伤与ERS有关，ERS一方面通过激活CHOP和caspase-12凋亡通路诱导肾脏细胞凋亡，另一方面通过促进MCP-1的表达加重肾脏炎症反应。第三部分固定时间和环境温度对ERS标志性蛋白GRP78和CHOP蛋白抗原稳定性的影响实验一、GRP78和CHOP在大鼠应激性肾损伤中的持续表达目的：由于当事人常经历非致死性创伤后一段时间内才发生死亡，故建立应激性损伤模型，从整体水平研究应激性肾损伤后一段时间内GRP78和CHOP的表达水平变化。方法：实验分为正常对照组和应激性损伤后0h,1d,3d,5d及7d组，每组5只大鼠。分别于造模后相应时间点处死大鼠，取材。采用IHC法观察大鼠肾脏的GRP78和CHOP的表达情况。结果：IHC半定量分析GRP78和CHOP在大鼠应激性肾损伤的持续表达应激性损伤后0h-7d大鼠肾脏GRP78和CHOP的表达水平均随时间的延长逐渐升高，在第3天达峰值，之后有所下降，但与对照组相比，均有统计学意义。该结果表明应激性损伤后一段时间内应用IHC技术仍能检测到GRP78和CHOP的表达。实验二、固定时间对GRP78和CHOP蛋白抗原稳定性的影响目的：研究固定时间对大鼠应激性损伤的肾组织中GRP78和CHOP抗原稳定性的影响。方法：实验分为正常对照组和应激性损伤组。每组5只大鼠，于造模后3d处死大鼠，取肾脏分别甲醛固定1d、3d、5d及7d后脱水，石蜡包埋。应用HE染色法观察大鼠肾脏组织形态学的变化；采用IHC发观察固定时间对大鼠肾脏的GRP78和CHOP抗原稳定性的影响。结果：1固定不同时间对肾脏HE染色结果的影响固定时间对两组肾脏组织的HE染色结果没有明显影响。与正常对照组相比，应激性损伤组大鼠肾损伤明显加重，均可见肾小球肿胀淤血，肾小囊闭塞，肾小管上皮细胞脱落，大量炎细胞浸润，间质淤血。2固定时间对肾脏GRP78和CHOP抗原稳定性的影响固定不同时间(3~7d)对肾脏GRP78和CHOP的抗原稳定性未见明显影响。与正常对照组相比，应激性损伤组肾脏GRP78和CHOP表达均明显增高(p<0.05)。实验三、环境温度对GRP78和CHOP蛋白抗原稳定性的影响目的：研究环境温度对大鼠应激性损伤后离体肾组织中GRP78和CHOP抗原稳定性的影响。方法：实验分为正常对照组和应激性损伤组。每组5只大鼠，于造模后3d处死大鼠，取肾脏：①在4℃下分别放置1d、3d、5d、7d、9d及11d；②在17℃及25℃下分别放置1d、3d、5d及7d后进行取材、固定、包埋。应用HE染色法观察不同环境温度下大鼠肾脏组织形态学的变化；采用IHC法观察环境稳定对大鼠肾脏GRP78和CHOP抗原稳定性的影响。结果：1不同环境温度下放置不同时间对肾脏组织结构的影响不同环境温度下，随着放置时间的延长，肾脏组织自溶变化逐渐明显加重。4℃放置至第9d，17℃和25℃分别放置至第3d，均可见不同程度的肾细胞结构模糊，部分细胞核缺失，胞浆溶解，胞浆呈均质化伊红色。但正常对照组和应激组大鼠肾脏形态学变化已无法区分。24℃和17℃保存对GRP78和CHOP抗原稳定性的影响4℃放置1~9d，17℃放置1~3d，应激性损伤组肾脏的GRP78和CHOP的表达强度与范围均逐渐减弱，但与对照组相比，仍有一定差异(p<0.05)。325℃保存对GRP78和CHOP抗原稳定性的影响放置1~3d，应激性损伤组肾脏GRP78的表达强度与范围均逐渐减弱，但与对照组相比仍明显增高(p<0.05)。放置1d，与对照组相比，应激性损伤组肾脏CHOP的表达强度仍明显增强(p<0.05)，但随放置时间延长，其肾脏CHOP的表达强度与范围均逐渐减弱，放置3d~7d与对照组相比无明显差异。小结：1GRP78和CHOP抗原稳定性较好，在大鼠应激性损伤后肾脏组织固定7d以内，均可检测到GRP78、CHOP的表达。2GRP78和CHOP抗原稳定性较好，大鼠应激性损伤后肾脏组织在4℃放置1-9d、17℃和25℃放置1-3d内均可检测到GRP78的表达。CHOP抗原稳定性稍弱于GRP78，大鼠应激性损伤后肾脏组织在4℃放置1-9d、17℃和25℃放置1d内仍能检测到CHOP的表达。综上，本实验成功建立了大鼠束缚应激和挤压伤复合模型即应激性损伤模型，观察了损伤后大鼠肾脏的病理学变化；检测了肾脏中内质网应激、细胞凋亡及炎症因子表达情况；以及组织固定时间和环境变化对肾脏中GRP78和CHOP抗原稳定的影响，成功地建立了诊断应激性肾损伤的指标体系：(1)明确的机械性损伤(交通伤、地震、矿难、刑讯逼供等)的体表征象。(2)肾脏的组织学变化为肾小球肿胀淤血，肾小管上皮细胞脱落，大量炎细胞浸润，间质淤血。(3)通过TUNEL可证实肾脏存在细胞凋亡，电镜下也可见肾小管细胞核周间隙增大，染色质轻度边移等凋亡现象。(4)肾脏ERS特异性蛋白GRP78和CHOP的表达明显增高。但该指标体系尚有待于在实际检案中进行验证。