论文部分内容阅读
甘蔗鞭黑粉菌[Sporisorium scitamineum(Syd.)M.Piepenber,M.Stoll&F.Oberw]引起的黑穗病是甘蔗上一种世界性的病害,严重影响甘蔗的质量和产量。目前对于甘蔗鞭黑粉菌有性配合的分子机制知之甚少,从基因水平研究该菌的有性配合机理,将可为发展新的防治策略提供理论依据。本实验室前期研究自甘蔗鞭黑粉菌单倍体菌株WT18筛选到一株有性配合能力明显减弱的T-DNA插入突变体菌株A9,获得了其插入位点的侧翼序列。为了进一步明确因插入而引起突变的该基因及其在有性配合过程中的功能,本研究预测了该基因结构,并通过基因敲除、功能互补及其表型及致病性等对该基因功能进行了分析,主要结果如下:1.分析了突变体A9被T-DNA插入破坏的基因结构。生物信息学分析表明被T-DNA破坏的基因全长1365 bp,含有一个29 bp的内含子,编码454个氨基酸;所编码的蛋白含有一个G-Patch保守结构域,拟命名该基因为SsGpa;蛋白比对显示该基因与玉米丝轴黑粉菌(Sporisorium reilianum)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)的uncharacterized protein基因分别有66%的同源性和57%同源性。2.获得了用于研究基因SsGpa功能的敲除突变体和功能互补体。根据基因SsGpa序列及上、下游序列设计了3对特异性引物,分别构建了基于基因SsGpa的敲除载体和功能互补载体,采用根癌农杆菌介导的遗传转化进行了基因敲除和功能互补;通过PCR检测、Southern杂交筛选、实时荧光定量PCR分析,表明原突变体菌株A9所突变的基因为SsGpa。3.基因SsGpa影响甘蔗鞭黑粉菌有性配合,而不影响其生长。与野生型对应性系WT17的有性配合结果显示,突变体A9和敲除突变体?SsGpa有性配合能力明显减弱,只能在菌落边缘长出微弱的菌丝,而互补体SsGpa-c恢复到野生型WT18的水平;显微观察和生长速率测定结果表明,?SsGpa、SsGpa-c、WT17和WT18形态上没有差异,生长速率基本一致。4.转录组分析显示基因SsGpa影响甘蔗鞭黑粉菌有性配合过程的信息素调控因子基因(prf1)的表达a位点和b位点通过Prf1作为转录激活因子激活,信息素合成基因(mfa)和基因bEast(bE)表达量显著下调。实时荧光定量PCR检测了mfa和pra在野生型和突变体中的表达量,结果显示mfa在?SsGpa中表达量明显低于野生型,而SsGpa-c表达量恢复到接近野生型的表达量,pra在野生型和突变体中的表达没有变化,表明基因SsGpa影响了基因mfa的表达,进而影响了甘蔗鞭黑粉菌的信息素的合成,导致不能进行有性配合。5.基因SsGpa的突变可显著影响甘蔗鞭黑粉菌的致病能力。致病力测定结果显示?SsGpa与WT17混合的致病力极弱,发病率为3.33%;SsGpa-c与WT17混合接种甘蔗的发病率接近野生型,发病率为73.33%。以上结果表明甘蔗鞭黑粉菌基因SsGpa与有性配合密切相关,其作用机制极可能是通过影响信息素合成基因mfa的表达,导致有性配合能力的减弱,继而降低了对甘蔗的致病能力。