【摘 要】
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高灵敏、高特异的生物分析方法对于生命科学研究和疾病的早期诊断具有重要意义。传统的检测技术因灵敏度低、操作程序复杂、成本昂贵,无法满足科研或临床实验室的需求。CRISPR技术在近年来得到快速发展,已被广泛的应用于基因编辑、生物成像以及核酸检测等领域,成为目前生命科学研究的热点。因具有可编程性以及高灵敏度和高特异性,基于CRISPR/Cas系统的检测技术具有极其广阔的应用前景,被誉为“下一代分子诊断技
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高灵敏、高特异的生物分析方法对于生命科学研究和疾病的早期诊断具有重要意义。传统的检测技术因灵敏度低、操作程序复杂、成本昂贵,无法满足科研或临床实验室的需求。CRISPR技术在近年来得到快速发展,已被广泛的应用于基因编辑、生物成像以及核酸检测等领域,成为目前生命科学研究的热点。因具有可编程性以及高灵敏度和高特异性,基于CRISPR/Cas系统的检测技术具有极其广阔的应用前景,被誉为“下一代分子诊断技术”。CRISPR/Cas12a是核酸检测领域最为常用的CRISPR/Cas系统。Cas12a蛋白在CRISPR RNA（crRNA）的指导下,特异性的识别和剪切双链DNA靶标,同时激活高效的反式切割活性。基于这一特性,通过剪切单链DNA报告探针,建立CRISPR/Cas12a核酸扩增检测体系。本论文交叉整合临床检验诊断学、分子生物学、生物分析化学等多学科领域前沿技术,针对目前CRISPR分子诊断技术所面临的热点和难点问题,以CRISPR/Cas12a的反式切割活性为基础,对其剪切性能和工作机制进行深入的探讨,发展全新的CRISPR/Cas12a通用检测平台,用于核酸、蛋白标志物的检测与原位成像,为生命科学研究以及疾病的早期诊断提供技术支撑,为生物分析方法的开发提供新的思路和实验基础。本研究主要包括以下两个部分:1 CRISPR/Cas12a固相界面侧切活性探索及电化学核酸检测新方法研究快速、高灵敏的等温检测技术是即时核酸诊断的关键。RNA引导的CRISPR/Cas12a系统具有双链DNA诱导的非特异性单链脱氧核糖核酸酶（ss DNase）活性。本部分详细研究了CRISPR/Cas12a系统对固相界面发夹DNA（hpDNA）报告探针和线性DNA报告探针的ss DNase裂解活性。通过靶标诱导活化的Cas12a蛋白剪切电极表面修饰的发夹DNA电化学报告探针,研制了一种新型的电化学DNA生物传感平台。在本部分研究中,RNA引导下目标DNA的识别激活Cas12a高效的反式切割活性。固载在电极表面的发夹DNA报告探针因具有较低的表面覆盖率和更低的空间位阻,且发夹探针环部的单链DNA暴露于电极表面,为Cas12a提供了更适宜的剪切底物,提高了CRISPR/Cas12a的反式剪切效率,从而提高了CRISPR/Cas12a电化学生物传感的分析性能。在最佳条件下,该传感平台在1小时内可检测出低至30 pM的靶DNA,在50 pM至100 n M之间具有良好的线性范围,动态范围达3.5个数量级。此外,本部分研究还验证了所建立的传感方法在复杂基质中对靶核酸的检测能力。所提出的策略为快速和高灵敏的核酸检测提供有力的技术支撑,为现场快速的分子诊断提供了潜在的实用性检测工具。2基于邻位PAM组装的CRISPR/Cas12a通用检测系统研究CRISPR/Cas12a在crRNA的引导下精确的识别含有PAM位点的双链DNA（dsDNA）,同时释放非特异的反式切割活性,为分子诊断提供一种高效的信号扩增检测工具。在本部分研究中,通过拆分PAM位点,详细研究了不同的PAM核苷酸缺失类型对CRISPR/Cas12a反式切割效率的影响。揭示了PAM位点在CRISPR/Cas12a反式切割活性激活过程中的作用,以及Cas12a蛋白增强链置换反应并促进crRNA入侵dsDNA靶标链的可能机制。与此同时,证明了带有缺口的dsDNA可被CRISPR/Cas12a系统特异的识别并更高效地启动CRISPR/Cas12a反式切割效应。通用结合邻位诱导的PAM动态组装,开发了一种基于CRISPR/Cas12a的模块化信号扩增检测系统。因不同种类的靶标可以通过相应的亲和配体识别,该系统已成功的应用于DNA和PDGF-BB的检测以及胞内BCR/ABL1 mRNA成像,具有较高的灵敏度和特异性。本部分的工作对CRISPR/Cas12a系统工作机制的深入认识以及基于CRISPR/Cas12a的分子诊断传感平台的开发与合理设计提供了重要的指导意义。
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