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外观品质是蔬菜重要的商品性状。番茄作为典型的果菜类蔬菜，具有丰富的果实形状类型，是研究浆果发育调控的模式植物。番茄果实由单个子房发育膨大而成，人工选择和驯化使其以圆球形为基础沿不同轴向突起或凹陷，形成不同的果实形状。研究表明番茄不同的果形由单个或多个基因突变导致。目前已经克隆了多个调控果实纵向和横向细胞生长的基因，例如SUN、OVATE、LC、FAS等。果实纵向生长过程中的细胞形态直接或间接取决于细胞骨架的动态，例如微管。但是，关于细胞骨架如何影响番茄果实形状的调控通路仍不清楚，需要克隆新的果形控制基因和解析由其所介导的分子机理来进行完善。同时，细胞骨架对番茄株形的影响研究较少，也需要进一步研究。
本论文包括两部分内容，第一部分内容是通过图位克隆的方法鉴定了调控番茄果实形状的MELONGENODIA(Mel)基因，确定该基因编码一个棕榈酰胺转移酶(palmitoyltransferase，PAT)，转基因分析确定了该基因果实形状调控功能。另外，我们首次发现了棕榈酰化修饰影响番茄果实形状，揭示了Mel通过棕榈酰化调控果实微管相关蛋白实现均质生长的分子机理。第二部分内容是克隆和鉴定了番茄植株螺旋生长控制基因，HELICAL(Hel)，并阐明了该基因编码的微管结合蛋白调控植株形态发生的机理。本论文主要研究结果如下：
Ⅰ番茄果形调控基因Mel的克隆鉴定及其分子机理研究
1.确定了mel突变体的长圆形果实表型是由于子房细胞的纵向伸长导致，明确了其果形在开花之前就已经确定；利用mel突变体和醋栗番茄LA1589杂交构建了F2和BC1F2遗传分离群体，采用BSR-seq方法和分子标记分析将mel定位于第5号染色体两个分子标记5D-19及Ch5-20之间，其物理距离约为159kb。番茄参考基因组注释信息显示该区域内包含19个可能的ORFs(ORF1-19)；基因序列扩增测序和比对分析确定ORF9在mel突变体中于起始密码子ATG下游1320bp发生了单碱基的缺失，该突变导致基因编码提前终止。因此，我们把ORF9列为Mel的候选基因。
2.利用CRISPR方法在野生型材料LA2838A中敲除ORF9，结果使圆形果实转变为长圆形果实；利用ORF9自启动子驱动ORF9在mel突变体LA0963中表达使长圆形果实变为正圆形果实；相反，我们在mel突变体中超量表达ORF9能够使长圆形果实变成扁圆形。这些实验结果表明ORF9即为Mel。
3.Mel编码一个棕榈酰胺转移酶PAT，是定位于质膜的膜蛋白。组织表达分析表明Mel在番茄幼嫩部位表达量较高；Mel基因启动子驱动GUS的组织化学染色表明Mel在顶端分生组织和果实中胎座表达。
4.我们在Mel所编码蛋白的DHHC保守结构域引入突变，即MelC209S蛋白，使其不具有棕榈酰化转移酶活性，并将其转入mel突变体LA0963中，表型观察发现其不能将长圆形果实变为扁圆形果实，表明Mel的棕榈酰化酶活性对于果实均质生长至关重要。同时，对圆果番茄LA2838A喷施棕榈酰化特异的抑制剂2-BP导致其果实变长，表明棕榈酰化修饰对果实均质生长不可或缺。通过生物素替换分析法和蛋白组学定量分析发现LA2838A与mel-cr敲除系中存在棕榈酰化水平差异的蛋白，其中26个蛋白在敲除系中显著下调，例如钙调素CAM1。通过IP-MS鉴定了Mel蛋白混合物中可能与其直接互作或者间接结合形成复合体的蛋白共78个，其中包括CAM1以及一个调控微管成束的微管结合蛋白MAP65-1。
5.通过Co-IP证明了Mel与MAP65-1直接互作。利用CRISPR敲除LA2838A中的MAP65-1可使其果实变长，但变长程度没有mel-cr那样明显。进一步在map65-1-cr系中分别超量表达MAP65-1和在预测棕榈酰化修饰位点引入无效突变的MAP65-1C17A，均能使敲除系恢复野生型圆果表型，说明MAP65-1对于果实纵向伸长的调控不依赖于Mel的棕榈酰化。杂交构建的map65-1-cr与mel-cr双敲除突变体果型指数与mel-cr单突变无显著差异，说明它们对于果实纵向伸长的调控可能是同一通路，Mel对MAP65-1有上位效应。同样，通过Co-IP分析证明了MAP65-1还可与CAM1存在直接蛋白互作，但MAP65-1不能与CAM1C27S蛋白互作，说明MAP65-1与CAM1的蛋白互作依赖棕榈酰化修饰。
基于上述结果，我们推测Mel可能通过对CAM1进行棕榈酰化修饰进而影响CAM1与MAP65-1的蛋白互作，调控微管的动态变化影响细胞的均质生长，且Mel、MAP65-1以及CAM1两两互作，共同决定番茄果实的形状。
Ⅱ番茄植株螺旋生长Hel基因鉴定
1.番茄hel突变体植株的螺旋生长是由于细胞的扭曲以及螺旋排列导致。通过BSR-seq和分子标记将hel定位于4号染色体长臂，位于分子标记SNP4-3和SNP4-6之间大约390kb的区域内。区域内包含13个可能的ORF，其中只有ORF2的CDS在突变体中的基因型相比于野生型有27bp的片段替换导致翻译提前终止。
2.在野生型材料中利用CRISPR敲除ORF2出现了与hel突变体相似的螺旋生长表型；在hel突变体中超量表达ORF2可使其恢复野生型形态。这些结果表明了ORF2即为Hel。
3.Hel编码的一个微管结合蛋白，与拟南芥的纤维素合成酶互作蛋白CSI1同源，其功能是作为周质微管与纤维素合酶复合体的物理连接，调控细胞壁的形态。hel突变体与拟南芥csi1突变体表型显著不同，可能存在未知的调控机制，有待进一步研究。
本论文包括两部分内容，第一部分内容是通过图位克隆的方法鉴定了调控番茄果实形状的MELONGENODIA(Mel)基因，确定该基因编码一个棕榈酰胺转移酶(palmitoyltransferase，PAT)，转基因分析确定了该基因果实形状调控功能。另外，我们首次发现了棕榈酰化修饰影响番茄果实形状，揭示了Mel通过棕榈酰化调控果实微管相关蛋白实现均质生长的分子机理。第二部分内容是克隆和鉴定了番茄植株螺旋生长控制基因，HELICAL(Hel)，并阐明了该基因编码的微管结合蛋白调控植株形态发生的机理。本论文主要研究结果如下：
Ⅰ番茄果形调控基因Mel的克隆鉴定及其分子机理研究
1.确定了mel突变体的长圆形果实表型是由于子房细胞的纵向伸长导致，明确了其果形在开花之前就已经确定；利用mel突变体和醋栗番茄LA1589杂交构建了F2和BC1F2遗传分离群体，采用BSR-seq方法和分子标记分析将mel定位于第5号染色体两个分子标记5D-19及Ch5-20之间，其物理距离约为159kb。番茄参考基因组注释信息显示该区域内包含19个可能的ORFs(ORF1-19)；基因序列扩增测序和比对分析确定ORF9在mel突变体中于起始密码子ATG下游1320bp发生了单碱基的缺失，该突变导致基因编码提前终止。因此，我们把ORF9列为Mel的候选基因。
2.利用CRISPR方法在野生型材料LA2838A中敲除ORF9，结果使圆形果实转变为长圆形果实；利用ORF9自启动子驱动ORF9在mel突变体LA0963中表达使长圆形果实变为正圆形果实；相反，我们在mel突变体中超量表达ORF9能够使长圆形果实变成扁圆形。这些实验结果表明ORF9即为Mel。
3.Mel编码一个棕榈酰胺转移酶PAT，是定位于质膜的膜蛋白。组织表达分析表明Mel在番茄幼嫩部位表达量较高；Mel基因启动子驱动GUS的组织化学染色表明Mel在顶端分生组织和果实中胎座表达。
4.我们在Mel所编码蛋白的DHHC保守结构域引入突变，即MelC209S蛋白，使其不具有棕榈酰化转移酶活性，并将其转入mel突变体LA0963中，表型观察发现其不能将长圆形果实变为扁圆形果实，表明Mel的棕榈酰化酶活性对于果实均质生长至关重要。同时，对圆果番茄LA2838A喷施棕榈酰化特异的抑制剂2-BP导致其果实变长，表明棕榈酰化修饰对果实均质生长不可或缺。通过生物素替换分析法和蛋白组学定量分析发现LA2838A与mel-cr敲除系中存在棕榈酰化水平差异的蛋白，其中26个蛋白在敲除系中显著下调，例如钙调素CAM1。通过IP-MS鉴定了Mel蛋白混合物中可能与其直接互作或者间接结合形成复合体的蛋白共78个，其中包括CAM1以及一个调控微管成束的微管结合蛋白MAP65-1。
5.通过Co-IP证明了Mel与MAP65-1直接互作。利用CRISPR敲除LA2838A中的MAP65-1可使其果实变长，但变长程度没有mel-cr那样明显。进一步在map65-1-cr系中分别超量表达MAP65-1和在预测棕榈酰化修饰位点引入无效突变的MAP65-1C17A，均能使敲除系恢复野生型圆果表型，说明MAP65-1对于果实纵向伸长的调控不依赖于Mel的棕榈酰化。杂交构建的map65-1-cr与mel-cr双敲除突变体果型指数与mel-cr单突变无显著差异，说明它们对于果实纵向伸长的调控可能是同一通路，Mel对MAP65-1有上位效应。同样，通过Co-IP分析证明了MAP65-1还可与CAM1存在直接蛋白互作，但MAP65-1不能与CAM1C27S蛋白互作，说明MAP65-1与CAM1的蛋白互作依赖棕榈酰化修饰。
基于上述结果，我们推测Mel可能通过对CAM1进行棕榈酰化修饰进而影响CAM1与MAP65-1的蛋白互作，调控微管的动态变化影响细胞的均质生长，且Mel、MAP65-1以及CAM1两两互作，共同决定番茄果实的形状。
Ⅱ番茄植株螺旋生长Hel基因鉴定
1.番茄hel突变体植株的螺旋生长是由于细胞的扭曲以及螺旋排列导致。通过BSR-seq和分子标记将hel定位于4号染色体长臂，位于分子标记SNP4-3和SNP4-6之间大约390kb的区域内。区域内包含13个可能的ORF，其中只有ORF2的CDS在突变体中的基因型相比于野生型有27bp的片段替换导致翻译提前终止。
2.在野生型材料中利用CRISPR敲除ORF2出现了与hel突变体相似的螺旋生长表型；在hel突变体中超量表达ORF2可使其恢复野生型形态。这些结果表明了ORF2即为Hel。
3.Hel编码的一个微管结合蛋白，与拟南芥的纤维素合成酶互作蛋白CSI1同源，其功能是作为周质微管与纤维素合酶复合体的物理连接，调控细胞壁的形态。hel突变体与拟南芥csi1突变体表型显著不同，可能存在未知的调控机制，有待进一步研究。