T细胞受体(T cell receptor,TCR)是表达于T细胞表面的异二聚体复合物,是T细胞的重要表面标志,其中αβTCR识别由主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)分子递呈的抗原肽。TCRα链和β链均有三个互补决定区(complementary determining regions,CDRs)–CDR1、CDR2和CDR3,其中CDR3区与抗原肽识别和结合有关,不同的CDR3序列代表不同的T细胞克隆,即一种CDR3序列就是一种T细胞克隆,因此通过监测CDR3的谱型变化可以反映T细胞的克隆性。目前,由于基因扫描-谱型分析技术具有快速、敏感和高效的特点,已作为肿瘤、病毒感染、自身免疫病及移植排斥反应中检测T细胞TCR CDR3谱型变化的常规技术,现已成功揭示了机体免疫稳定状态下及临床疾病状态下αβTCR的变化规律,并将抗原特异的TCR基因用于免疫治疗中,已取得了一定的成果。迄今为止,国内外对猪T细胞TCR在病原感染和疫苗免疫状态下的研究很少,但猪的免疫学尤其是T细胞免疫机制的研究不仅有助于猪病防控,也有助于人类异体器官移植。因此,本研究主要利用基因谱型分析技术研究临床健康猪T细胞αβTCR基因的多样性及猪瘟C株疫苗免疫后CD4~+T细胞αβTCR的寡克隆性,为深入研究猪瘟病毒感染的细胞免疫机制以及猪瘟新型疫苗的研制提供技术和理论基础。本研究取得的主要进展如下:1.成功分析了临床健康猪CD4~+和CD8~+T细胞TCRα链和β链基因家族CDR3区谱型及长度多样性。采用RT-PCR基因扫描分析技术从健康猪CD4~+和CD8~+T细胞中克隆了猪的19个TCR AV和20个TCR BV基因家族。谱型分析结果表明,19个TCR AV和20个TCR BV基因家族在两类细胞亚群中均有表达,且每个家族的谱型均呈典型的高斯分布,多数家族含有八种以上不同长度的CDR3序列,相邻CDR3序列间一般相差3 bp,表明健康状态下T细胞受体CDR3区具有长度和序列多样性。此外,同一TCR家族在两种T细胞亚群的表达频率不同,即使是同一细胞亚群,不同家族的表达水平也有差异。这种临床健康猪CD4~+和CD8~+T淋巴细胞αβTCR的多样性有利于机体识别各种抗原肽,以维持免疫内环境的稳定。2.成功分析了猪瘟C株疫苗免疫后猪CD4~+T细胞αβTCR的变化规律。以猪瘟C株疫苗免疫4头同窝合作小型猪,利用基因扫描–谱型分析技术分析免疫前后CD4~+T细胞TCR各家族CDR3区谱型变化。结果显示,大多数谱型变化的家族在免疫后第3天即抗体产生之前就出现克隆性扩增的变化,且这种克隆化趋势达到高峰后逐渐减退,直至免疫后第15天TCR的谱型又恢复到了免疫前的高斯分布。#884猪TCR AV14、AV38和TCR BV6S,#888猪TCR AV8-3S和TCR BV30,#892猪TCR AV5S、AV8-3S、AV8-4S、AV14和TCR BV4S、BV7S、BV15家族呈现单寡克隆化增殖趋势。其中,TCR AV14在#884和#892猪,TCR AV8-3S在#888和#892猪均呈克隆化表达,且TCR AV5S、AV38和TCR BV6S在猪瘟病毒C株感染的外周血单个核细胞中也有发现,表明PBMCs和CD4~+T细胞可能对猪瘟病毒同一抗原肽产生了免疫应答。3.成功分析了猪瘟C株疫苗免疫的呈克隆性扩增的CD4~+T细胞TCR AV和BV家族CDR3的保守氨基酸基序。RT-PCR扩增上述TCR基因家族的CDR3区并进行克隆测序和生物信息学分析,发现尽管同一基因家族CDR3序列不完全相同,但其都含有保守的氨基酸序列。所有呈克隆性扩增的TCR AV家族CDR3区均含有“LX”基序,BV家族具有保守的“GGA”基序。这些保守的CDR3氨基酸基序可能与猪瘟病毒抗原肽识别和结合有关,这为猪瘟多肽疫苗的高通量筛选和开发奠定了基础。4.成功扩增了猪瘟病毒C株特异的TCR AV5S和TCR BV6S全长基因序列,在序列分析的基础上构建了两个真核表达质粒并进行共转染表达研究。基因序列分析表明,克隆的TCR AV5S全长816 bp,编码272个氨基酸;克隆的TCR BV6S全长945 bp,编码315个氨基酸。体外单独转染和共同转染表明两种质粒可以实现体外共表达,这为猪瘟病毒抗原特异TCR基因的免疫学功能验证模型建立了实验方法。