阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是一种慢性神经退行性疾病,临床主要表现为进行性记忆减退和认知障碍。AD发病机制复杂,至今尚未阐明,从而严重阻碍了有效的AD防治药物的开发。近年来,多项研究表明,神经炎症在AD的发生发展过程中具有重要作用。小胶质细胞作为中枢神经系统常驻的免疫细胞,其介导的神经炎症机制与AD的发生发展密切相关。一方面小胶质细胞在中枢神经系统损伤反应和病原体防御中具有关键作用,另一方面持续激活的小胶质细胞会释放大量细胞毒性因子,介导神经元突触的吞噬等。小胶质细胞对外界刺激非常敏感,在AD多种病理条件刺激下,如淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）沉积、氧化应激等,会引起小胶质细胞持续性激活,这与AD的发生发展紧密相关。因此,小胶质细胞已成为AD研究领域的热点之一。中枢神经系统是一个由多种细胞构成的复杂体系,AD的发生也并非是单一系统或某一细胞群的病变。越来越多的研究表明,AD小胶质细胞活化与神经元损伤密切相关。AD神经元产生的Aβ、过度磷酸化的tau蛋白等均会激活小胶质细胞,提示小胶质细胞过度活化可能是神经元出现病理损害后的结果。但近年来也有文献报道在Aβ病理出现之前,已存在小胶质细胞的过度激活状态,提示小胶质细胞的过度激活又可能是神经元出现病理损害的原因。因此研究神经元与小胶质细胞间的相互作用关系是了解神经炎症和神经变性发生发展及作用关系的重要切入点,对于理解AD的发病机制具有重要意义。目前研究AD使用的细胞来源主要有2种,永生化细胞和原代细胞。但这两种来源的细胞各有局限性。永生化细胞虽然可以大量扩增,但是经过基因编辑后使其无法展现出原代细胞的相关特性;原代细胞具有较好的生理或病理的相关性,但来源非常有限,人源的原代细胞更是稀少。人诱导性多能干细胞（human induced pluripotent stem cells,hiPSCs）是由人体细胞重编程而来,如果是患者来源的hiPSCs,会携带患者的遗传物质,其分化的神经细胞包含疾病发生发展过程中的基因修饰和突变。因此AD患者来源的hiPSCs诱导分化的小胶质细胞,可以为研究人员提供良好的细胞模型,在AD病理机制的研究和抗AD药物研发领域有广泛的应用前景。首先,本课题应用前期建立的hiPSCs向小胶质细胞诱导分化的方案,将年轻人、认知正常老年人和AD患者来源的hiPSCs分别诱导分化为小胶质细胞,观察这三种来源小胶质表型和功能的差异,并比较多种外源性刺激因素对其的影响;继而研究三种来源小胶质细胞与神经元共同孵育所致的相互影响;最后应用hiPSCs源小胶质细胞评价药物对hiPSCs源小胶质细胞活化的影响。第一部分hiPSCs源小胶质细胞的诱导分化及多种外源性刺激因素对其表型和功能的影响首先将年轻人（Young control,YC）、认知正常老年人（Cognitively normal elderly control,CNC）和 AD hiPSCs诱导分化为小胶质细胞。然后应用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,及多种AD相关刺激因素,包括过氧化氢（hydrogenperoxide,H2O2）、皮质醇（cortisol,CORT）和 β-淀粉样蛋白寡聚体（β-amyloid oligomers,oAβ）,观察这些外源性刺激对三种来源hiPSCs源小胶质细胞表型和功能的影响,及YC、CNC和AD hiPSCs源小胶质细胞对上述刺激反应的差异。1.hiPSCs向小胶质细胞诱导分化应用实验室前期建立的诱导分化实验方案,将三种hiPSCs诱导分化为小胶质细胞。应用流式细胞术检测分化过程中hiPSCs源性造血祖细胞CD43和CD34的阳性细胞率,结果显示CD43和CD34阳性细胞率均在90%以上,各组结果无明显差异。应用免疫荧光法检测小胶质细胞特异性表面蛋白IBA1和TMEM119,结果显示hiPSCs源小胶质细胞IBA1和TMEM119阳性细胞率在90%以上,各组小胶质细胞阳性细胞率无明显差异。以上结果提示,三种hiPSCs均可诱导分化为小胶质细胞,各组间分化效率无明显差异。2.多种外源性刺激对hiPSCs源小胶质细胞表型和功能的影响应用LPS及AD相关刺激因素H2O2、CORT、oAβ处理细胞,观察多种外源性刺激对三组小胶质细胞表型及功能的影响,以及观察三组小胶质细胞反应的差异。应用CCK-8检测细胞活力,应用中性红吞噬实验检测细胞吞噬能力,应用化学发光法检测细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,应用luminex检测细胞分泌细胞因子水平（IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-6、CXCL10 和 CCL7）,应用 ELISA试剂盒检测细胞内 oAβ水平。2.1 LPS对hiPSCs源小胶质细胞表型和功能的影响给予刺激前,AD组小胶质细胞细胞活力、吞噬能力和ROS水平显著高于CNC组。1μg/ml LPS可显著增加三组小胶质细胞的细胞活力、吞噬能力和ROS水平,且AD组上述指标仍显著高于CNC组。2.2 H2O2对hiPSCs源小胶质细胞表型和功能的影响给予刺激前,AD组小胶质细胞细胞活力、吞噬能力和ROS水平显著高于CNC组。25 μM H2O2可显著增加三组小胶质细胞细胞活力、吞噬能力和ROS水平,而AD组上述指标仍显著高于CNC组。2.3 CORT对hiPSCs源小胶质细胞表型和功能的影响给予刺激前,AD组小胶质细胞细胞活力、吞噬能力和ROS水平显著高于CNC组。25 μM CORT可显著增加三组小胶质细胞细胞活力、吞噬能力和ROS水平,且AD组上述指标仍显著高于CNC组。2.4 Aβ寡聚体（oAβ）对hiPSCs源小胶质细胞表型和功能的影响给予刺激前,AD组小胶质细胞细胞活力、吞噬能力和ROS水平显著高于CNC组。1μM oAβ可显著增加三组细胞细胞活力、吞噬能力和ROS水平,且AD组上述指标仍显著高于CNC组。2.5降解Aβ寡聚体（oAβ）的能力检测1 μM oAβ孵育结束后0,3,6和9 h细胞内oAβ含量。结果显示AD组小胶质细胞内oAβ摄入含量高于YC和CNC;终止孵育后0～9h,oAβ含量在YC和CNC组小胶质细胞内下降较快,并且在9 h时二者细胞内oAβ剩余含量无明显差异,AD组小胶质细胞内oAβ剩余含量显著高于CNC组,提示其oAβ清除能力低于YC和CNC组。以上结果表明,4种外源性刺激因素均可引起三组小胶质细胞表型和功能的改变。其中YC和CNC组小胶质细胞表型和功能在刺激前后均无明显差异,而AD组小胶质细胞细胞活力、吞噬能力、细胞因子分泌水平和ROS水平在刺激前后均显著高于CNC组,但降解oAβ能力低于CNC组。提示三组小胶质细胞对外源性刺激因素的反应不同,AD组小胶质细胞在多种外源性因素刺激前后,均表现出更高的炎症反应和氧化应激反应,以及更弱的清除oAβ的能力。第二部分不同来源hiPSCs源小胶质细胞与神经元相互影响的研究本部分主要研究hiPSCs源小胶质细胞与神经元间的相互作用。1.hiPSC源小胶质细胞对hiPSCs源神经元表型的影响应用YC、CNC和AD三组小胶质细胞培养上清液,分别干预三组神经元,观察未给予刺激和给予LPS刺激条件下,三组小胶质细胞上清对相应三组神经元表型的影响。应用CCK-8检测细胞活力、InCuCyte zoom细胞实时动态成像分析系统检测神经突长度、TUNEL（TdT-mediated dUTP Nic-End Labeli ng）法检测细胞凋亡水平和化学发光法检测ROS水平。结果显示,未给予LPS刺激的三组小胶质细胞上清对YC和CNC组神经元细胞活力、神经突长度、凋亡水平和ROS水平均无明显影响,但显著增加AD组神经元ROS水平。给予LPS刺激的三组小胶质细胞上清均可显著降低各组神经元的细胞活力,减少神经突长度,增加神经元凋亡水平和ROS水平。与YC和CNC组小胶质细胞相比较,LPS刺激后AD组小胶质细胞上清降低了三组神经元细胞活力、神经突长度,增加神经元凋亡水平和ROS水平最为显著,对AD组神经元的影响程度最为明显。提示LPS刺激后三组小胶质细胞具有损伤神经元的作用,AD组小胶质细胞对各来源神经元的损伤作用最为明显,且对AD组神经元的作用最为显著。2.hiPSCs源神经元对hiPSC源小胶质细胞表型和功能的影响应用三组神经元的细胞培养基上清液,分别干预相应三组小胶质细胞,观察三组神经元对三组小胶质细胞表型和功能的影响。结果表明,YC和CNC组神经元上清对三组小胶质细胞的细胞活力、吞噬能力和ROS水平均无影响。AD组神经元上清会显著增加三组小胶质细胞的细胞活力和吞噬能力;对YC组小胶质细胞ROS水平无明显影响,显著增加CNC和AD组小胶质细胞ROS水平,AD组小胶质细胞ROS水平增加最为明显。提示AD组神经元会引起各组小胶质细胞活化,对AD组小胶质细胞的作用最为明显。第三部分应用hiPSCs源小胶质细胞评价抗AD药物的抗炎免疫活性课题组前期研究发现,六味地黄苷糖（LW-AFC）的活性部位之一 LWD-b（主要由苷类和酚酸类成分组成）能够通过调节神经免疫调节作用改善AD模型小鼠的认知功能。此部分应用YC、CNC和AD三组小胶质细胞,进一步研究了 LWD-b及其7种活性成分的抗炎活性。LWD-b的给药浓度为100μg/ml,芍药苷、莫诺苷、獐牙菜苷、麦角甾苷、马钱苷、马钱苷酸浓度均为100 μM,没食子酸50 μM,实验中设立溶剂对照组、LPS刺激组。检测细胞活力、吞噬能力、分泌细胞因子水平和ROS水平。1.LWD-b及其活性成分对hiPSCs源小胶质细胞细胞活力的影响应用CCK-8法检测细胞活力,结果显示,LWD-b及其活性成分对三组小胶质细胞的细胞活力无明显影响;给予LPS刺激会显著增加三组小胶质细胞细胞活力。马钱苷对LPS刺激后YC组小胶质细胞细胞活力有明显的抑制作用;莫诺苷和马钱苷对LPS刺激后CNC组小胶质细胞细胞活力有明显的抑制作用;芍药苷、莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷、马钱苷酸、没食子酸对LPS刺激后AD组小胶质细胞细胞活力有明显的抑制作用。2.LWD-b及其活性成分对hiPSCs源小胶质细胞吞噬能力的影响应用中性红吞噬实验检测细胞吞噬能力,结果显示LWD-b及其活性成分对未给予LPS刺激三组小胶质细胞的吞噬能力无明显影响。给予LPS刺激会显著增加三组小胶质细胞吞噬能力。马钱苷对LPS刺激后YC组小胶质细胞吞噬能力有明显的抑制作用;莫诺苷和马钱苷对LPS刺激后CNC组小胶质细胞吞噬能力有明显的抑制作用;芍药苷、莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷、马钱苷酸、没食子酸对LPS刺激后AD组小胶质细胞吞噬能力有明显的抑制作用。3.LWD-b及其活性成分对hiPSCs源小胶质细胞分泌细胞因子能力的影响应用luminex检测细胞分泌细胞因子水平,结果显示,LPS刺激可显著增加三组来源组小胶质细胞细胞因子分泌能力。LWD-b、马钱苷、马钱苷酸、没食子酸可显著抑制LPS刺激后YC组小胶质细胞分泌TNF-α水平;马钱苷可显著抑制LPS刺激后YC组小胶质细胞IL-6水平。莫诺苷、马钱苷、马钱苷酸、没食子酸可显著抑制LPS刺激后CNC组小胶质细胞分泌TNF-α水平;马钱苷可显著抑制LPS刺激后CNC组小胶质细胞分泌IL-10水平;莫诺苷、没食子酸可显著抑制LPS刺激后CNC组小胶质细胞分泌CXCL10水平。马钱苷酸可显著抑制LPS刺激后AD组小胶质细胞分泌IL-6、IL-1β;LWD-b、莫诺苷、马钱苷、马钱苷酸、没食子酸可显著抑制LPS刺激后AD组小胶质细胞分泌TNF-α和CXCL10水平;莫诺苷、马钱苷酸、没食子酸显著抑制LPS刺激后AD组小胶质细胞分泌CCL7 水平。4.LWD-b及其活性成分对hiPSCs源小胶质细胞ROS水平的影响应用化学发光法检测组小胶质细胞ROS水平。LWD-b及其活性成分对三组小胶质细胞的ROS水平无明显影响。LPS刺激可以显著增加YC、CNC及AD组小胶质细胞ROS的水平。莫诺苷、马钱苷、没食子酸、马钱苷酸可以显著降低LPS刺激后YC组小胶质细胞ROS水平;马钱苷、没食子酸、马钱苷酸可以显著降低LPS刺激后CNC组小胶质细胞ROS水平;马钱苷、没食子酸、马钱苷酸、LWD-b可以显著降低LPS刺激后AD组小胶质细胞ROS的水平。上述结果表明,LWD-b及其活性成分能够不同程度地降低LPS刺激后三种来源的小胶质细胞的炎症反应和氧化应激反应。其中,马钱苷和马钱苷酸效果最为显著,提示上述药物能够较好的抑制小胶质细胞细胞的活化状态。通过以上结果,本研究得到以下结论:（1）成功将年轻人、认知正常老年人和AD患者来源的hiPSCs诱导分化为小胶质细胞。（2）4种外源性刺激均可引起三种hiPSCs源小胶质细胞炎症反应和氧化应激反应。添加刺激因素前,AD患者hiPSCs源小胶质细胞已表现出较强的炎症反应和氧化应激反应;添加刺激因素后,AD患者hiPSCs源小胶质细胞的反应更为明显,能够较好地反映出AD相关的病理变化,为后续进一步开展相应的机制研究提供实验依据。（3）三种hiPSCs源小胶质细胞与hiPSCs源神经元能够相互影响。未给予LPS刺激时的AD患者来源小胶质细胞即可损伤神经元,LPS刺激后三种小胶质细胞均有损伤神经元的作用。AD患者hiPSCs源神经元可以激活三种hiPSCs源小胶质细胞,对AD患者hiPSCs源小胶质细胞作用最为显著。（4）LWD-b及其活性成分能够不同程度地降低LPS刺激后三种来源的hiPSCs源小胶质细胞的炎症反应和氧化应激反应。其中,马钱苷和马钱苷酸效果最为显著,提示可以应用hiPSCs源小胶质细胞评价药物的抗炎活性。