胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,是世界范围排名第二的致死性疾病,也是我国肿瘤相关死亡的主要原因,尤其在亚洲国家包括中国和日本有很高的发病率。尽管胃癌的发病率较以前有所下降,但世界上每年仍有超过1,000,000例新增诊断病例以及850000例全球死亡病例。胃癌的发生是一个复杂的进程,包含多种因素、多种步骤、以及编码的和不编码的基因。胃癌的危险因素包括幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染,基因因素,高盐饮食,熏制食物,吸烟和酗酒等。这些因素能引起正常胃粘膜向浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生、异型增生转变,最终发展为胃癌。H.pylori感染是其中比较重要的危险因素之一。并且早在1994年世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)就把H.pylori定为Ⅰ类致癌原,但迄今为止,H.pylori引起胃癌的确切机制对人类来讲依然是未知数。尽管H.pylori被划为致癌因子和清除H.pylori以防止胃癌发生的治疗措施并未被普遍接受,但是现代流行病学显示,H.pylori在肠型和弥散型胃癌的发展过程中都发挥了重要作用,大约有高达80%的非贲门胃癌的发生都归因于H.pylori。流行病学评价显示H.pylori的持续感染超过10年会导致浅表性胃炎进一步发展为萎缩性胃炎,伴随着病程的发展,这种萎缩会在胃体中从幽门腺延伸至胃底腺,在随后的10年或更长时间便会出现肠化生。H.pylori感染会增加胃癌发生的概率,H.pylori的清除至少可以减缓胃萎缩或肠化生的进程,从而可以减少胃癌发生的危险因素。研究表明,H.pylori感染能影响mi RNAs的表达水平,提示H.pylori可能通过调控基因水平而对胃癌的发生及发展发挥作用。但目前对于H.pylori如何通过mi RNAs介导胃癌发生的研究少有报道。mi RNAs是一类小的非编码RNA分子,包含大约19-24nt。许多基因编码mi RNAs是单纯拷贝、多个拷贝或基因簇。其他形式存在于蛋白编码基因或内含子的沉默区。它们是高度保守的、暂时的和组织特异性的。尽管mi RNAs不编码为蛋白,但他们可以在转录后水平调节基因的表达。通过与目标m RNAs 3’-UTRs完全或不完全的互补结合,它们进行染色质重组,沉默特异基因,分裂、破坏m RNAs,抑制转录后的表达等。mi RNA调节基因的表达,有助于生长、分化、炎症和肿瘤化。目前,已经有超过24500进入mi R的数据库,表明有超过30000成熟的mi RNAs的产品,并且mi RNAs的数量在未来有望增加。研究发现超过30%的人类基因都受mi RNAs调节,一个mi RNA可能调控上百种RNA的表达。许多mi RNAs的异常表达与胃癌的发展息息相关。一些研究发现mi RNAs不仅是肿瘤的生物学标志,而且是肿瘤靶向治疗的手段。micro RNA-222,简写mi R-222,最先在脐静脉内皮细胞(HUVECs)中被发现,在上皮性肿瘤中起到重要作用。研究表明,mi R-222在多种肿瘤类型中存在异常表达。除此以外,在恶性胶质瘤、甲状腺乳头状癌、肝细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌中,mi R-222在细胞增殖方面的作用亦被肯定,体外研究发现mi R-222能增强细胞增殖速度和迁移能力。然而,近期的一个研究发现,mi R-222能抑制非小细胞性肺癌的生长。另外,在红白血病中,mi R-222通过下调c-kit基因能起抑癌基因的作用。这提示mi R-222在肿瘤中的作用可能具有二元性。除了在肿瘤方面的作用,mi R-222参与了很多生理性和病理性的过程,比如能增加心肌肥大,促进肺动脉平滑肌细胞的增殖等等。目前mi R-222在胃癌的发生发展中研究较少,其在胃癌中的作用及机制尚不完全清楚。本研究从临床的胃癌病理样本出发,首先通过生物信息学软件预测出3-5个可能的mi R-222-3p的靶基因,然后通过分筛H.pylori 26695阳性和阴性的胃癌组织样本,并利用q RT-PCR检测胃癌组织中mi R-222-3p与可能靶基因的表达,分析mi R-222-3p与靶基因在H.pylori 26695感染阳性的胃癌样本中的相关性。利用双荧光素酶及Western Blot实验验证mi R-222-3p与其新的靶基因HIPK2的关系。免疫组化方法检测胃癌组织中HIPK2的表达。体外实验,分别验证mi R-222-3p和HIPK2对SGC-7901胃癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。体内实验,通过裸鼠成瘤来验证mi R-222-3p和HIPK2对肿瘤生长的影响。最终探讨mi R-222-3p/HIPK2轴在胃癌发生发展过程中的生物学作用。第一部分胃癌组织中mi R-222-3p与H.pylori及临床病理类型的相关性分析目的:探讨胃癌组织中mi R-222-3p与H.pylori感染及临床病理类型相关性,验证mi R-222-3p是否参与H.pylori26695感染诱发胃癌的致病过程,为深入研究胃癌的发生机制打下前期基础。方法:采用q RT-PCR方法检测mi R-222-3p的表达水平。采用Spearman等级相关分析mi R-222-3p与临床病理因素的关系。结果:mi R-222-3p的表达与性别、年龄、大小、侵袭深度及淋巴结转移均无显著相关(P>0.05),mi R-222-3p表达水平在Ⅲ、Ⅳ期表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期表达水平(P<0.05),与胃癌TNM分期呈正相关(P=0.007<0.01)。H.pylori感染阳性的胃癌组织中mi R-222-3p的表达显著高于H.pylori感染阴性胃癌组织中mi R-222-3p的表达(P<0.001)。结论:胃癌组织中mi R-222-3p的表达与H.pylori感染呈正相关。组织中mi R-222-3p的表达与胃癌TNM分期正相关,可作为进展期胃癌的评价指标之一。第二部分mi R-222-3p的靶向性研究及靶基因的功能验证目的:探索mi R-222-3p新的靶基因,验证胃癌组织中靶基因与mi R-222-3p的表达及H.pylori感染的相关性。分析靶基因HIPK2在SGC-7901胃癌细胞中的功能。方法:采用q RT-PCR检测待测靶基因HIPK2、CPEB3及PCDHA11的表达,并分析与mi R-222-3p表达的相关性。靶向性荧光素酶实验验证mi R-222-3p与可能靶基因的调控关系,筛选出潜在靶基因HIPK2进行验证。WB检测mi R-222-3p对HIPK2的靶向调控。CCK8法检测HIPK2 sh RNA慢病毒感染SGC-7901细胞后细胞的增殖情况。流式细胞术检测HIPK2 sh RNA慢病毒感染SGC-7901细胞后细胞的凋亡情况。Transwell检测HIPK2 sh RNA慢病毒感染SGC-7901细胞后细胞的侵袭情况。免疫组化检测胃癌组织中HIPK2的表达情况。采用Pearson相关分析HIPK2与mi R-222-3p的关系。结果:胃癌组织中mi R222-3p的表达与HIPK2及PCKHA11呈负相关(P<0.05),组织中mi R-222-3p的表达与CPEB3无相关性(P>0.05)。相对于mimic NC,mi R-222-3p mimic转染293细胞后,HIPK2-3’UTR荧光素酶质粒转染组的相对荧光素酶(Rluc/Fluc)显著下降(P<0.01)。mi R-222-3p mimics转染后SGC-7901细胞中HIPK2的表达显著下调(p<0.05),mi R-222-3p inhibitor转染后SGC-7901细胞中HIPK2的表达无明显下调(P>0.05)。与NC sh RNA慢病毒感染相比,HIPK2sh RNA慢病毒感染后SGC-7901细胞增殖速率显著提高(P<0.001)。HIPK2 sh RNA慢病毒感染后SGC-7901细胞凋亡率显著下降(P<0.01)。HIPK2 sh RNA慢病毒感染后,SGC-7901细胞侵袭能力显著增加(P<0.01)。H.pylori感染阳性胃癌组织样本中HIPK2的免疫组化染色评分较H.pylori感染阴性胃癌组织样本中低,H.pylori感染阳性胃癌组织中HIPK2表达低。组织中mi R-222-3p的表达与HIPK2呈负相关(P<0.05)。结论:HIPK2为mi R-222-3p新的靶基因之一。干扰HIPK2表达,能够促进SGC-7901胃癌细胞系增殖、侵袭,抑制其凋亡。胃癌组织中HIPK2的表达与mi R-222-3p及H.pylori负相关。第三部分mi R-222-3p/HIPK2轴在胃癌发生发展中的生物学作用目的:探讨mi R-222-3p在胃癌细胞中的功能,分别在胃癌细胞和裸鼠实验两方面就mi R-222-3p/HIPK2轴在胃癌发生发展中的生物学作用进行研究,为胃癌的基因治疗提供一定的依据。方法:利用CCK8法检测mi R-222-3p OE、mi R-222-3p KD慢病毒感染SGC-7901细胞的生长活性。流式细胞术检测mi R-222-3p OE、mi R-222-3p KD慢病毒感染SGC-7901细胞的凋亡水平。Transwell检测mi R-222-3p OE、mi R-222-3p KD慢病毒感染SGC-7901细胞的侵袭能力。q RT-PCR检测LV-mi R-222-3p OE、LV-HIPK2OE慢病毒感染SGC-7901细胞中mi R-222-3p的表达。WB检测LV-mi R-222-3p OE、LV-HIPK2 OE慢病毒感染SGC-7901细胞中HIPK2蛋白的表达。验证mi R-222-3p/HIPK2轴对SGC-7901细胞生长、凋亡和侵袭的影响。SGC-7901细胞皮下接种建立裸鼠成瘤模型,利用mi R-222-3p和HIPK2慢病毒进行瘤内感染,验证mi R-222-3p/HIPK2对SGC-7901皮下成瘤的影响。结果:mi R-222-3p OE慢病毒感染SGC-7901细胞后,SGC-7901细胞的生长速度加快,凋亡能力下降,侵袭能力增强(P<0.01)。mi R-222-3p KD慢病毒感染SGC-7901细胞后作用相反。与LV-NC组相比,LV-mi R-222-3p OE感染组细胞中mi R-222-3p基因的表达量明显上调(P<0.05);与LV-mi R-222-3p OE+LV-NC相比,LV-mi R-222-3p OE+LV-HIPK2 OE感染组细胞中mi R-222-3p基因的表达量明显下调(P<0.05)。LV-mi R-222-3p OE感染后细胞中HIPK2蛋白的表达量显著下调(P<0.001);LV-mi R-222-3p OE与LV-HIPK2 OE同时感染时,LV-mi R-222-3p OE感染导致的细胞中HIPK2蛋白表下调现象得到显著回复(P<0.001)。LV-mi R-222-3p OE感染后SGC-7901细胞的增殖速率显著加快(P<0.01),SGC-7901细胞的凋亡率显著下调(P<0.01),SGC-7901细胞侵袭能力增强(P<0.001)。LV-mi R-222-3p OE与LV-HIPK2 OE同时感染后,mi R-222-3p过表达诱导的SGC-7901生长加速现象受到显著抑制(P<0.001),SGC-7901细胞凋亡率下调现象受到显著的回复(P<0.001),SGC-7901细胞侵袭能力增强的现象受到显著抑制(P<0.001)。与NC组相比,mi R-222-3p OE感染后,SGC-7901细胞皮下植瘤生长速度显著加快(P<0.001)。mi R-222-3p OE和HIPK2 OE同时感染时,HIPK2显著抑制mi R-222-3p过表达诱导的皮下瘤体增殖(P<0.001)。结论:mi R-222-3p靶向调控HIPK2的表达。过表达mi R-222-3p,促进SGC-7901胃癌细胞的增殖、侵袭,抑制其凋亡。过表达HIPK2抑制mi R-222-3p对SGC-7901胃癌细胞增殖,侵袭的促进及凋亡的抑制作用。体内成瘤实验发现,过表达mi R-222-3p促进肿瘤生长,过表达HIPK2可以抑制mi R-222-3p促进肿瘤生长的作用。