目的:本文以马氏珠母贝全脏器为材料,通过酶解法提取马氏珠母贝多糖(以下简称珠母贝多糖),采用氯磺酸-吡啶法对珠母贝多糖进行硫酸酯化修饰,并体外评价了珠母贝多糖及其硫酸酯化衍生物的细胞免疫调节活性,同时探讨硫酸酯化珠母贝多糖有效成分的构效关系。方法:1采用单因素试验,测试反应温度、反应时间、酯化试剂比例、酯化试剂与多糖溶液的体积比等因素对硫酸酯化珠母贝多糖的取代度DS和总糖含量的影响;在单因素试验研究的基础上,采用响应面分析法优化出珠母贝多糖硫酸酯化的工艺条件。2.采用DEAE-纤维素柱层析法分离纯化珠母贝多糖级分;采用高效液相色谱法测定珠母贝多糖纯化组分PMPS-1及其硫酸酯化多糖PMPS-1-S的相对分子量、纯度;采用红外光谱法、核磁共振光谱法对珠母贝多糖组分及其硫酸酯化衍生物进行分析。3.采用MTT法体外研究小鼠脾淋巴细胞的增殖效果;采用中性红法体外研究小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。结果:1.单因素试验结果表明,反应温度、反应时间、酯化试剂比例、酯化试剂与多糖溶液的体积比对取代度DS变化趋势有显著影响,但对总糖含量的变化趋势影响不大。响应面分析法结果表明,取代度DS的最优条件是反应温度为70℃,反应时间为4.6 h,酯化试剂比例为1:4,酯化试剂与多糖溶液的体积比为6:5,在此条件下取代度DS达到1.44,总糖含量为76.41%。2.珠母贝多糖分离纯化得到三个纯化组分(PMPS-1,PMPS-2,PMPS-3)。PMPS-1、PMPS-1-S为均一的多糖组分,且PMPS-1和PMPS-1-S的相对分子量分别为1.69×104Da,2.98×106Da。B(DS 0.26)、C(DS 0.42)、D(DS 0.56)及E(DS 1.14)这四种硫酸酯化衍生物均表现出多糖的特征吸收峰且它们的硫酸基取代度不同。PMPS-1、PMPS-1-S均表现出多糖的特征吸收峰且均为α型吡喃糖,PMPS-1-S的硫酸基团取代在C-6位置上且有两个取代信号。3.(1)对小鼠脾淋巴细胞免疫活性的影响:不同取代度的硫酸酯化衍生物检测结果显示,A(DS 0.12)、B(DS 0.26)、C(DS 0.42)、D(DS 0.56)及E(DS 1.14)均具有促进淋巴细胞增殖的能力,其增殖效果能力为E>D>C>B>A;与阳性药物Con A/LPS合用后,均能表现出单纯增强或协同作用。PMPS-1和PMPS-1-S的结果显示,PMPS-1、PMPS-1-S也均具有促进淋巴细胞的增殖活性,其增值效果能力为PMPS-1-S>PMPS-1;与阳性药物Con A/LPS合用后,也均表现出单纯增强或协同作用。(2)对小鼠腹腔巨噬细胞免疫活性的影响:B(DS 0.26)、C(DS 0.42)、D(DS0.56)、E(DS 1.14)、PMPS-1及PMPS-1-S在所选剂量下几乎均能促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红且具有一定的量效关系。对于吞噬中性红能力来说,在相同的剂量条件下,E(DS 1.14)和PMPS-1-S剂量组的效果最好。A(DS 0.12)在所选剂量下均不同程度地增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力,但无统计学意义。结论:(1)珠母贝多糖硫酸酯化最佳工艺条件是反应温度为70℃,反应时间为4.6 h,酯化试剂比例为1:4,酯化试剂与多糖溶液的体积比为6:5,在此条件下取代度DS达到1.44,总糖含量为76.41%。(2)B(DS 0.26)、C(DS 0.42)、D(DS 0.56)及E(DS 1.14)这四种硫酸酯化衍生物具有不同硫酸基取代度;PMPS-1-S的硫酸基团取代在C-6位置上。(3)珠母贝多糖及其硫酸酯化衍生物均具有增强细胞免疫活性的能力,且与Con A/LPS合用能起到协同增强免疫作用的效果;珠母贝多糖进行硫酸酯化修饰可以明显提高其细胞免疫活性。