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本研究应用现代分子生物学的研究手段和方法,对籽鹅和东北白鹅抑制素和活化素β<,B>亚基成熟区基因进行了克隆和原核表达。本试验采用普通的Trizol方法从籽鹅和东北白鹅卵泡组织中提取总RNA,然后经逆转录酶反转录成cDNA,自行设计并合成一对特异性引物,应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,成功地扩增出籽鹅和东北白鹅β<,B>亚基成熟区cDNA基因,并定向插入pMD18-T载体中,然后经PCR鉴定及限制性内切酶双酶切鉴定,鉴定正确的质粒进行序列测定,用DNAstar软件将所测得的序列与GeneBank上发表的鸡抑制素和活化素β<,B>亚基基因序列比较,核苷酸序列基本一致,且籽鹅和东北白鹅抑制素和活化素β<,B>亚基成熟区cDNA与鸡的核苷酸同源性均达到99.7%,表明所构建的籽鹅和东北白鹅β<,B>亚基成熟区基因序列是正确的。
将筛选得到的籽鹅和东北白鹅抑制素和活化素β<,B>亚基成熟区cDNA的阳性克隆子经双酶切后,连接入经同样内切酶BamHⅠ和HandⅢ消化的表达载体pET-32a Vector中,构建重组表达载体pET-32a-IA,将筛选到的重组表达载体转化到表达菌株BL21(DE3)中,在低温条件下(28℃)用。IPTG诱导其进行表达,并制备了目的蛋白的包涵体,进行表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳检测。结果显示,表达的蛋白带均位于约34KDa处,籽鹅和东北白鹅INH/ACTβ<,B> 亚基成熟区基因获得表达。
本研究获得了籽鹅和东北白鹅INH/ACT β<,B>亚基成熟区基因和原核表达重组质粒,并且获得了籽鹅和东北白鹅该基因在大肠杆菌中的表达,为鹅抑制素和活化素的研究奠定了基础。