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目的对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1中第二信使分子环鸟苷二磷酸(cyclic di-guanylate mono-phosphate,c-di-GMP)代谢相关的基因进行研究及探讨,以期加深对铜绿假单胞菌致慢性感染的相关分子机制的理解。方法从同行实验室获得PAO1野生型菌株及多个C-di-GMP代谢相关的具有GGDEF、EAL及GGDEF-EAL结构域基因的转座子突变体菌株。首先采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),以来确认各个突变菌株的转座子插入情况。之后对转座子突变菌株进行生物膜(Biofilm)和泳动性(Motility)表型分析,通过表型的变化,筛选出感兴趣的基因。利用PCR技术将相关基因的催化结构域进行克隆以及构建原核表达载体。成功构建的表达载体经IPTG诱导,进行重组蛋白的表达及分析。选择溶解性良好的重组蛋白进行生物学活性分析,使用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)的方法,参照标准品以及文献,以分析重组蛋白的催化活性。结果1.通过聚合酶链式反应实验,使用转座子特异引物及基因特异引物,得到明亮清晰的条带,确认转座子插入预期的基因位点中,导致其失活成为突变菌株;而无明亮条带出现的则为插入失活失败,即为非转座子插入菌株。2.对野生型PAO1菌株和筛选出的四个GGDEF-EAL突变菌株进行Biofilm表型分析比较。在LB液体培养基中生长12小时的各株细菌,经结晶紫染色,生物膜定量分析,统计结果表明,与野生型PAO1相比,PA0285、PA0575、PA5442基因插入失活,导致生物膜变化差异显著,有统计学意义(P<0.05),而PA5295变化不明显,无统计学意义(P>0.05)。3.对野生型PAO1菌株和四个GGDEF-EAL突变菌株进行Motility表型分析,测量同一平板上的野生型PAO1和转座子突变体菌株的菌落直径。PA0285、PA0575、PA5442转座子突变体菌落直径与野生型PAO1间具有显著差异(P<0.05),而PA5295转座子突变体与PAO1间无显著差异(P>0.05)。4.综合分析多个转座子突变菌株的表型分析,辅以大量相关研究文献,对尚未研究报道而我们感兴趣的多个GGDEF-EAL结构域基因进行克隆,转化入E.coli DH5α中并验证是否构建成功。测序验证后再将表达载体转入E.coli BL21,以IPTG诱导产生蛋白,并用SDS-PAGE进行检测。5.选取体外表达的可溶性蛋白PA0847,进行体外生物学活性分析,使用高效液相色谱技术对蛋白的体外催化活性进行检测,得出其在体外有鸟甘酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)的活性,即PA0847的GGDEF结构域在体外表现出了C-di-GMP合成酶的活性。结论研究者们已知具有GGDEF/EAL结构域的基因涉及细菌中第二信使C-di-GMP的合成与分解,并影响细菌的诸多生理功能。为了进一步了解这些相关基因是通过何种分子机制来影响细菌的生理过程,我们对GGDEF/EAL结构域的基因进行表型的初步分析,挑选出在表型上有显著差异的基因,经基因克隆和相关蛋白的表达分析,选取PA0847基因进行体外催化活性分析。最终我们验证了PA0847蛋白的DGC活性,这为我们深入分析PA0847的作用机制奠定了基础,也为我们进一步理解C-di-GMP在铜绿假单胞菌中的生物学功能提供一些启示。