促红细胞生成素抗心肌缺血再灌注损伤的实验研究

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一.EPO抗乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的实验研究目的建立乳鼠心肌细胞H/R模型,观察EPO对心肌细胞H/R损伤的保护作用,揭示EPO抗心肌细胞H/R损伤的机制,探讨其作用的信号通路。方法1.进行乳鼠心肌细胞的原代分离纯化,建立细胞H/R模型。实验分组包括空白组,对照组,EPOL组,EPOM组,EPOH组,UO126组。2.MTT法检测细胞存活率;比色法检测上清液LDH,CK-MB。3.TUNEL法及Annexin-V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡率。4.TBA法测定细胞内MDA含量,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。5.Western法测定细胞ERK1/2及磷酸化ERK1/2蛋白含量。结果1.H/R损伤导致心肌细胞膜通透性增加,存活率下降,凋亡率增加,MDA含量升高,SOD活性降低,而一定浓度的EPO显著减少心肌酶的释放,提高心肌细胞活性,减轻细胞凋亡,提高SOD活性。2.各组ERK1/2蛋白的表达总量无明显差异;而在H/R损伤和外源性EPO的作用下,磷酸化ERK1/2蛋白含量增加。结论EPO在体外对心肌细胞H/R损伤有一定的保护作用,与其抑制心肌细胞凋亡,减少氧自由基生成有关,且可能是通过启动ERK1/2通路信号转导进行。二.Langendorff模型下EPO抗心肌缺血再灌注损伤的实验研究目的建立Langendorff离体心脏灌注模型,观察不同剂量的EPO预处理对离体心脏血流动力学等指标的影响,评价EPO对MIRI的保护作用,通过检测凋亡相关基因的蛋白表达,测定炎症因子mRNA含量变化,探讨EPO对MIRI保护作用的分子生物学机制。方法1.建立Langendorff离体心脏灌注模型,分组包括,空白组,对照组,EPOL组,EPOM组,EPOH组。2.记录心功能参数:HR,LVSP,±dp/dtmax,及CF。3.检测冠脉流液中LDH,CK含量。4.免疫组化法检测Bax,Bcl-2,NF—κB P65的蛋白表达。5.荧光实时定量PCR法测定TNF—α,IL—1β,ICAM-1的mRNA水平。结果1.MIRI对心功能有负性影响,心肌酶释放增加;一定浓度的EPO增加心肌收缩力,改善心肌舒张功能,扩张冠脉血管。2.MIRI诱导心肌细胞凋亡,而EPO能通过差异调节Bcl-2和Bax的蛋白表达抑制凋亡。3.心肌组织经过MIRI后,NF-κB发生活化,致炎因子基因转录水平增高,而EPO能抑制相关作用。结论一定浓度EPO对离体心脏的MIRI有保护作用,其机制与抑制心肌细胞凋亡,调控NF-κB的活化并减轻致炎因子介导的心肌炎症反应相关。三.在体模型下EPO抗心肌缺血再灌注损伤的实验研究目的建立大鼠MIRI在体模型,记录血流动力学指标,统计心律失常情况,测定血清心肌酶谱值,观察心肌超微结构,研究EPO对大鼠MIRI的影响。方法1.建立大鼠MIRI在体模型,实验分组包括:空白组,I/R组,EPO组。2.连续心电监测并记录各时间点出现的心律失常。3.生物信号采集处理系统记录HR,LVSP,±dp/dtmax。4.检测血清AST,CK-MB,LDH。5.电镜下观察左心室组织超微结构。结果MIRI诱导严重心律失常的发生率升高,心肌的收缩和舒张功能损伤,心肌酶释放增加,并破坏细胞超微结构;而EPO降低心律失常发生率,改善心功能,减轻生物膜损伤,保护心肌细胞的超微结构。结论EPO对在体模型上的大鼠MIRI具明显的保护作用。
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